论文部分内容阅读
基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)是一类依赖于Zn2+的蛋白水解酶家族的总称,能够精确的调节细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的降解。当MMPs调控失衡后,在组织细胞中就会发生过量表达,导致一些疾病的发生。MMPs对关节炎、癌症和心血管疾病等的发生有着重要的影响,以MMPs作为靶点,筛选MMPs抑制剂,已经成为很多疾病的治疗策略,尤其是癌症治疗中的一条重要途径。本文主要研究MMP-13的原核诱导表达、色谱纯化与复性、MMP-13抑制剂的筛选,并制备MMP-13-抑制剂复合物,为抑制剂抑制位点的研究奠定基础。论文主要包括以下内容:1.文献综述对癌症治疗策略及抗癌药物、基质金属蛋白酶及其抑制剂、蛋白质复性方法、蛋白质结构研究等四个方面的国内外研究现状进行了概括。2.重组MMP-13催化结构域蛋白的诱导表达以大肠杆菌作为体外表达体系,用IPTG对MMP-13催化结构域蛋白进行诱导表达。比较了LB培养基和M9培养基对目标蛋白表达量的影响。结果表明,用LB培养基和M9培养基表达MMP-13的表达量分别为41.3%、39.8%。3.包涵体蛋白的纯化通过超声破碎、离心、包涵体洗涤、包涵体溶解等过程得到含有MMP-13的蛋白混合溶液。用Ni2+-亲和色谱对MMP-13蛋白进行纯化,通过条件优化,在平衡缓冲液咪唑浓度为15 mmol/L,蛋白上样量为1.20 mL(蛋白浓度为18.93 mg/mL),流速为1.00 mL/mim时,目标蛋白的纯度由75.2%增加到92.6%,质量回收率由60.7%增加到72.8%。4. MMP-13的复性分别使用两种方法对纯化蛋白进行了复性研究。一是离子交换色谱法,其复性过程分为两步:首先用三梯度离子交换色谱进行复性,通过对阴离子交换色谱条件优化,在上样量为0.40 mL(蛋白浓度为0.9360 mg/mL),流速为0.80 mL/min,洗脱梯度时间为25 min,B液pH为7.0时,质量回收率为84.2%,之后利用尺寸排阻色谱进行脱盐,质量回收率为21.3%,最终得到MMP-13的活性为1.188×105 mF.U./mn(阳性对照活性为1.209×105 mF.U./mn),1 L发酵液可得到活性蛋白质约18.6 mg。二是尺寸排阻色谱法,复性的质量回收率为31.7%,蛋白的活性为0.9916×105 mF.U./mn(阳性对照活性为1.209×105 mF.U./mn),1L发酵液可得到活性蛋白质约32.8 mg。5. MMP-13抑制剂的筛选及其对蛋白纯化、复性的影响考察了A12(SO4)3、FeCl3、K3[Fe(CN)6]等对MMP-13的抑制活性,并从中筛选出对MMP-13抑制活性最好的K3[Fe(CN)6] (IC5o为1.7μmol/L),考察其在包涵体前处理、蛋白纯化及复性过程中对MMP-13产量的影响,结果发现抑制剂能够明显提高MMP-13蛋白产量,加入K3[Fe(CN)6]后的蛋白质量回收率提高了30%左右,减少了蛋白在整个流程中的损失。6. MMP-13-抑制剂复合物的制备以K3[Fe(CN)6]、Al2(SO4)3作为抑制剂,分别制备出不含抑制剂的MMP-13复性蛋白、纯化复性过程中直接添加抑制剂的MMP-13-抑制剂复合物、复性后添加抑制剂的MMP-13-抑制剂复合物样品,为进一步利用X-射线晶体衍射和三维NMR技术研究MMP-13-抑制剂复合物结构,解析K3[Fe(CN)6]、Al2(SO4)3对MMP-13的抑制位点奠定基础。