论文部分内容阅读
目的:探讨制作血管性痴呆大鼠模型的方法。方法:①以改良的Pulsinelli’s四血管阻断(4-Vessel occlusion,4VO)法建立血管性痴呆(vascular dementia,VD)模型,成模后饲养4w,并通过Morris水迷宫定位航行试验和空间探索试验对该模型大鼠的学习记忆和空间记忆等行为学改变进行评价。②用HE染色后以光学显微镜观察各组大鼠海马区脑组织的病理变化。结果:①夹闲实验大鼠颈总动脉时间条件分析:模型术后4w水迷宫结果显示:1min组4只大鼠和2min组4只大鼠平均逃避潜伏期与假手术组的差异均无统计学意义(成活率100%,成模率为0);3min组4只都成活,只有1只成模(成活率100%,成模率25%);4min组成活3只都成模(成活率75%,成模率75%),死亡1只(死亡率25%);5min组成活并成模1只(成活率25%,成模率25%),死亡3只(死亡率75%)。②定位航行试验比较:模型术后4w,模型组和假手术组之间比较,模型组第2～4天平均逃避潜伏期较假手术组延长,差异有显著性意义(P＜0.01)。③空间探索试验比较:模型组与假手术组大鼠120s内在平台象限的平均滞留时间分别为27.66±5.39s,56.66±7.97s,两组比较差异有显著性意义(P＜0.01)。④各组大鼠海马区脑组织病理学改变:模型组脑海马CA1区锥体神经元细胞排列稀疏紊乱,神经元肿胀、脱失,细胞核体积变小,深染,固缩;假手术组大鼠无上述改变。结论:本实验对Pulsinelli’s四血管阻断法进行改良,摸索出成模的最佳条件为电凝双侧椎动脉,72h后反复夹闭双侧颈总动脉4min,共夹闭3次,每次间隔1h。改良后的4VO法制作的血管性痴呆模型具有痴呆成功率高、重复性好、痴呆症状稳定等优点,可以作为血管性痴呆模型用于基础实验研究。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的:探讨分离、纯化和传代培养骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)的方法,并对分离扩增的骨髓MSCs进行鉴定和标记。方法:用全骨髓细胞贴壁分离和消化控制相结合的方法分离、纯化和传代培养骨髓MSCs,并用流式细胞仪检测MSCs表面抗原及诱导其向骨细胞分化的方法对分离扩增的骨髓MSCs进行鉴定。结果:①取得较高纯度的大鼠骨髓MSCs,并保持细胞的活性;在体外培养条件下大鼠骨髓MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样。②流式细胞仪示,CD44阳性率为89.4%、CD90为99.2%,CD34为1.82%。经诱导骨髓MSCs向骨细胞分化后,茜素红S染色可见钙结节阳性。结论:本实验建立了一种可行的大鼠骨髓MSCs取材、分离纯化和扩增的方法。培养的骨髓MSCs纯度高,细胞活力强,生物学性状稳定。本实验通过全骨髓细胞贴壁分离和消化控制相结合的培养方法具有操作简便,条件要求低等优点,是目前一种比较理想的分离纯化方法。经流式细胞仪检测MSCs表面抗原及诱导其向骨细胞分化鉴定,分离扩增的细胞确实为MSCs。目的:初步探讨移植骨髓MSCs于VD大鼠海马,对实验大鼠认知功能的改善、病理结构的影响。方法:用脑立体定位技术将5-溴-2’-脱氧尿苷(Brdu)标记后的骨髓MSCs植入VD大鼠(MSCs移植组)海马内,并设模型对照组、培养基对照组及假手术组作对照,每组7只大鼠。饲养4周后以Morris水迷宫来检测大鼠的学习记忆和空间记忆能力。用HE染色后以光学显微镜观察各组大鼠海马区脑组织的病理变化。结果:①定位航行试验比较:MSCs移植后4周,模型对照组和假手术组各时段逃避潜伏期测试成绩之间经两样本均数比较t检验,模型对照组第2～4天逃避潜伏期明显长于假手术组,差异有显著性意义(P＜0.01)。模型对照组、MSCs移植组、培养基对照组逃避潜伏期均值之间进行两两比较,MSCs移植组第2～4天逃避潜伏期均比模型对照组缩短(P＜0.001),MSCs移植组第2～4天逃避潜伏期也均比培养基对照组缩短(P＜0.001),而各时段培养基对照组与模型对照组逃避潜伏期比较差异均无显著性意义(P＞0.05)。②空间探索试验比较:模型对照组、MSCs移植组、培养基对照组及假手术组大鼠120s内在平台象限的平均滞留时间分别为27.15±4.55s,54.45±7.37s,28.64±2.21s,57.99±8.91s,经两样本均数比较t检验,模型对照组较假手术组滞留时间短,两组比较差异有显著性意义(P＜0.01)。模型对照组、MSCs移植组、培养基对照组大鼠120s内在平台象限的平均滞留时间之间进行两两比较,MSCs移植组较模型对照组滞留时间长,两组比较差异有显著性意义(P＜0.001),MSCs移植组也较培养基对照组滞留时间长,两组比较差异有显著性意义(P＜0.001),而培养基对照组滞留时间与模型对照组滞留时间比较差异无显著性统计学意义(P＞0.05)。③各组大鼠海马区脑组织病理学改变:与模型对照组比较,培养基对照组上述改变无明显变化,而MSCs移植组大鼠脑海马CAl区组织的病理损伤明显减轻,锥体神经元排列较规则,肿胀、脱失神经元数目较少,核固缩明显减轻。结论:骨髓MSCs移植至海马,对VD大鼠空间学习记忆能力有改善作用,并且对反复的脑缺血引起的神经损伤有一定的保护作用。