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背景:孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder,ASD）属于儿童发育性神经障碍疾病,预后较差,其核心特征是社交功能障碍以及局限的、重复的行为、兴趣或活动。早期诊断ASD是改善患儿损伤程度并改善、缓解甚至预防与ASD症状相关的医学问题的可行和有用的步骤,但鉴于目前诊断主要依靠行为表现,大部分ASD患儿的诊断时间较晚,从而错过了最佳的干预时间,因此早期诊断需要更多的生物学特征和实验室指标。近年来的研究显示ASD源于神经嵴功能减退,而神经嵴发育中的缺陷也会引起外耳大小形态和头围的异常,这在许多综合征性ASD病例中被发现,但综合征性ASD仅占所有ASD病例的不到1%。尽管突变基因多变,但所有ASD在共同的症状学上趋于一致,研究发现常见的分子途径存在相通性,且许多分子途径与外耳发育相关。因此非综合征性ASD患儿可能也存在异常的外耳和头围发育模式,其能否作为ASD早期筛查诊断的生物学特征仍需要进一步研究。本研究首先通过分析山东大学第二医院儿童保健门诊正常汉族儿童的外耳大小形态数据,建立正常儿童外耳发育参数模型,之后比较非综合征性ASD患儿和正常儿童的外耳发育模式,并研究孕产期因素对非综合征性ASD和外耳、头发育的影响,最后比较非综合征性ASD患儿和正常儿童外周血中,外耳发育基因的差异表达情况,分析外耳发育与非综合征性ASD之间的相关性。第一部分正常儿童外耳发育的横断面研究研究目的通过分析山东大学第二医院儿童保健门诊常规查体的正常汉族儿童的外耳参数,建立正常汉族儿童的外耳发育模型。研究对象和方法1.研究对象:本研究选取2016年3月到2018年2月在山东大学第二医院儿童保健门诊查体的汉族儿童为主要研究对象,按照制定的入组标准筛选后,根据年龄分为14组（1～14岁）,并选择山东大学医学院18岁汉族本科生作为成年外耳数据参考标准。每组各包括30名男童（性）和30名女童（性）,共900名。纳入标准:（1）参考2005年中国9市儿童体格发育指标,身高、体重、头围均在正常范围内;（2）智力发育正常;（3）无外耳疾病史。排除标准:（1）身高或体重或头围不在正常范围内;（2）精神发育迟滞;（3）有外耳疾病史。2.研究方法:测量所有研究对象左右外耳的耳长和耳宽以及身高、体重、头围。为了更好的描述外耳的形状和比例,本研究引入耳指数,耳指数（auricular index,AI）=耳宽/耳长×100。比较外耳尺寸在不同性别和不同年龄组间的差异,观察外耳形态随年龄的变化趋势,并进一步分析外耳尺寸和体格发育之间的关系。研究结果1.本研究显示正常汉族儿童左右耳耳长、耳宽差异无统计学意义（P＞0.05）。男童的耳长从1岁时的4.86cm增至14岁时的6.67cm,女童从1岁时的4.69cm增至14岁时的6.40cm。耳宽男童从1岁时的3.00cm增至14岁时的3.64cm,女童从1岁时的2.80cm增至14岁时的3.47cm。每个年龄组的男童耳长和耳宽均大于同一年龄组的女童,且12岁以后耳长的差异均有统计学意义,6岁以后耳宽差异有统计学意义（P均≤0.05）。2.耳长、耳宽均与年龄存在正线性相关趋势,线性回归方程:男耳长（cm）=4.618+0.143×年龄（岁）、女耳长（cm）=4.54+0.136×年龄（岁）;男耳宽（cm）=3.210+0.037×年龄（岁）、女耳宽（cm）=3.133+0.029×年龄（岁）。3.AI值在3岁时达到最高值。男童为67.03,女童为67.78。4.耳宽与头围在不同性别、不同年龄组中均呈线性相关,相关系数范围为0.46～0.81。5.不同性别间头围/耳宽值呈正态性分布,男童（性）头围/耳宽值为14.68,女童（性）头围/耳宽值为14.95。6.与国内外不同地区人口外耳测量数据比较均存在差异。研究结论:1.本研究显示了不同年龄、不同性别汉族儿童外耳的耳长、耳宽数据,与国内外不同地区人口外耳测量数据比较存在差异。2.耳长、耳宽均与年龄存在正线性相关趋势,线性回归方程:男耳长（cm）=4.618+0.143×年龄（岁）、女耳长（cm）=4.54+0.136×年龄（岁）;男耳宽（cm）=3.210+0.037 ×年龄（岁）、女耳宽（cm）=3.133+0.029 × 年龄（岁）。3.耳指数在3岁时达高峰,随后下降,提示外耳在3岁时最接近圆形,此后逐渐变为窄长形。4.耳宽与头围在不同性别、不同年龄组中均呈正相关。5.不同性别的头围/耳宽值在不同年龄段相对固定,男童（性）头围/耳宽为14.68,女童（性）头围/耳宽为14.95。第二部分 儿童外耳发育与ASD的相关性分析:病例对照研究研究目的:比较非综合征性ASD汉族儿童外耳发育和正常对照组汉族儿童的差异。分析孕产期因素对非综合征性ASD的影响及对外耳异常和头围异常的影响。研究对象和方法:1.研究对象:ASD组收集了 2018年3月至2019年2月在山东大学第二医院儿童保健门诊就诊的非综合征性ASD汉族患儿41名,其中男童30名,女童11名,年龄3～7岁。纳入标准:（1）研究对象符合第5版《精神疾病诊断和统计手册》（The fifth edition of the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,DSM-5）中ASD的诊断标准;（2）研究对象的颅脑磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）、染色体、代谢筛查、脑电图、二代测序等检测均阴性。排除标准:（1）其他形式的普遍性发育障碍者;（2）具有明显染色体畸变或者代谢筛查异常或者二代测序异常者;（3）运动发育延迟者;（4）有基础疾病或先天性疾病史者。对照组收集了同一时期在山东大学第二医院儿童保健门诊就诊的正常发育汉族儿童264名,其中男童149名,女童115名,年龄3～7岁之间。纳入标准:（1）各时期神经运动发育均无延迟者;（2）无ASD家族史。排除标准:（1）任何形式的普遍性发育障碍者;（2）运动发育延迟者;（3）有基础疾病或先天性疾病史者。2.研究方法:根据对父母的访谈以及产妇健康记录,现场收集怀孕时父母的一般情况（比如年龄、学历、父母有无自身免疫性疾病史等）、母亲孕期情况如是否补充叶酸、是否有并发症（包括呼吸道感染、贫血、甲状腺功能异常、高血压、高血糖等）以及是否早产等资料,同时测量所有研究对象的身高、体重、头围、左右耳长、宽等数据。身高、体重、头围、左右耳长、宽的收集方式同第一部分。根据倾向得分匹配（Propensity Score Matching,PSM）分析方案,以分组变量（0=正常儿童,1=ASD儿童）为因变量,以儿童的性别和年龄作为匹配变量,SPSS 22.0软件自动采用logistic回归对自变量和因变量进行拟合并计算各样本的倾向值得分,按1:1的比例以最邻近匹配法匹配ASD儿童组和正常对照儿童组,设置卡钳值为0.02,完成匹配后去除匹配成功的正常儿童组,继续上述过程,直至不能完全匹配,共得到1:4的ASD组和正常对照组匹配。比较匹配后ASD组和对照组儿童的外耳和头围发育模式,并分析孕产期因素的影响。研究结果:1.ASD组大耳畸形的发生率为17.1%（n=7）,小耳畸形的发生率为7.3%（n=3）;对照组大耳畸形的发生率为1.8%（n=3）,小耳畸形的发生率为0.6%（n=1）,ASD组和对照组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.01）。2.ASD组大头畸形的发生率为22.0%（n=9）,小头畸形的发生率为17.1%（n=7）;对照组中大头畸形的发生率为1.8%（n=3）,小头畸形的发生率为1.8%（n=3）,ASD组和对照组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。3.ASD组和对照组AI分别为52.56和65.99,头围/耳宽值分别为16.27和14.83,两组间差异均有统计学意义（P均＜0.01）。4.母亲孕期是否补充叶酸和ASD的关联有统计学意义（P＜0.05）,OR（95%CI）为 3.69（1.76,7.76）。5.母亲孕期是否补充叶酸与大耳畸形和大头畸形的关联有统计学意义（P＜0.05）,OR（95%CI）分别为 8.13（1.63,40.61）和 4.16（1.18,14.60）。小耳畸形和小头畸形的相关因素分析未发现关联因素有统计学意义（P≥0.05）。研究结论:1.ASD组外耳异常的发生率高于对照组。2.ASD组头围异常的发生率高于对照组。3.ASD组患儿存在异常的外耳发育模式。4.孕期未补充叶酸是非综合征性ASD的危险因素。5.孕期未补充叶酸同时是大耳畸形和大头畸形的危险因素,未发现小耳畸形和小头畸形的危险因素。第三部分 ASD患儿外耳发育相关基因的差异表达分析研究目的:本部分研究筛选与外耳和头发育相关的基因,比较其在非综合征性ASD患儿和正常儿童外周血中的差异表达情况。研究对象和方法:1.研究对象:本研究招募了 2019年5月至2020年4月在山东大学第二医院儿童保健门诊就诊的非综合征性ASD汉族患儿8名,其中男童7名,女童1名,年龄2～7岁。对照组按性别年龄匹配的正常汉族儿童8名。2.研究方法:根据主题词加自由词的检索方式在基因表达数据库中分别检索与ASD、头和外耳的相关基因,用韦恩图筛选出与外耳和头发育相关的基因。抽取两组研究对象清晨空腹静脉血5ml,取外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,应用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）检测所筛选基因在 ASD 儿童和正常对照组儿童中的表达情况。研究结果:1.筛选相关的基因有:α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（alpha serine/threonine-protein kinase,AKT1）、B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2,BCL2）、同源盒 A1（hommeobox A1,HOXA1）、一氧化氮合酶 2（nitric oxide synthase 2,NOS2）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）和转化生长因子 β1（transforming growth factor beta 1,TGFB1）。2.外周血中AKT1 mRNA相对表达量ASD组为6.74,对照组为3.41;BCL2 mRNA相对表达量ASD组为0.12,对照组为0.23;HOXA1 mRNA相对表达量ASD组为0.07,对照组为0.19;差异均有统计学意义（P均＜0.05）。研究结论:1.ASD组患儿PBMC中AKT1 mRNA相对表达量高于对照组。2.ASD组患儿PBMC中BCL2 mRNA相对表达量低于对照组。3.ASD组患儿PBMC中HOXA1 mRNA相对表达量低于对照组。