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研究背景银屑病是一种常见的慢性炎性复发性皮肤病,主要表现有红斑、鳞屑等,中医称其为“白疕”,多因营血亏损,血热内蕴,生风生燥,肌肤失养而成。银屑病目前多从“血分”论治,血热证是其最常见的证型。清热凉血方是导师根据三十余年的临床经验从“犀角地黄汤”化裁而来。前期临床研究和基础实验证实清热凉血方通过多种生物学机制治疗银屑病安全、有效。而中药复方治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路的作用特点,清热凉血方干预银屑病的有效成分和机制尚未阐明。网络药理学是基于药物分子、基因、蛋白等多个公共数据库,运用现代生物信息学技术揭示中药对机体网络调控作用的一门学科。运用网络药理学可较好地阐释中药复方治疗疾病的“成分-靶点”网络。银屑病发病机制尚未明确,包括多基因遗传背景、T细胞免疫及环境的共同影响。银屑病尚无治愈的方法,现有的治疗手段难以使患者获得满意的效果。调节代谢可能是银屑病治疗的新思路。葡萄糖转运蛋白1(Glucose Transporter 1,GLUT1)是一种广泛表达的葡萄糖转运蛋白,可能通过促进表皮增殖、激活炎症以及血管生成等多种机制参与银屑病发病,并受到PI3K/AKT信号通路的调节。目前尚无清热凉血方及其活性成分是否通过PI3K/AKT/GLUT1信号通路治疗银屑病的研究。目的1、运用网络药理学挖掘清热凉血方治疗银屑病的可能活性成分及靶点。2、比较血热型银屑病患者皮损和健康对照组的皮肤中GLUT1蛋白的表达情况。3、基于体内、外实验,观察清热凉血方主要活性成分-槲皮素是否通过调控PI3K/AKT/GLUT1信号通路发挥对银屑病的治疗作用。方法研究一:通过数据库挖掘、文献检索构建了清热凉血方药物成分分子数据库;并利用计算机方法通过评估药物分子的ADME性质,获取清热凉血方的有效化学成分,进一步构建了成分-靶标网络,并通过蛋白互作、GOBP分析、Reactome通路分析揭示清热凉血方治疗银屑病的可能机制。研究二:入组血热型寻常型银屑病患者20名和健康对照组15名,运用免疫组织化学技术检测血热型银屑病患者皮损中GLUT1蛋白表达情况并比较两组有无差异。研究三:选用6～8周龄的BALB/c雄性小鼠47只,随机分为6组,空白对照组7只,其余各组每组8只。除空白对照组外,其余各组用含5%咪喹莫特乳膏涂抹在去毛的背部部位,1次/天,每次62.5 mg,持续7天。雷公藤组灌胃浓度为7.56 mg/kg雷公藤多苷液,槲皮素低、中、高组分别灌胃浓度为30mg/kg、60mg/kg及120mg/kg的槲皮素溶液,空白对照组和模型组均灌胃等渗盐水。干预7天后,第8天采集小鼠背部皮损和血清。通过肉眼观察皮损改变并进行PASI评分,HE染色比较皮肤组织病理改变并测量表皮厚度变化,免疫组织化学技术检测小鼠皮损中GLUT1蛋白表达,实时荧光定量PCR技术检测小鼠皮损中AKT mRNA和GLUT1 mRNA的相对表达量,Western Blot检测小鼠皮损中AKT、pAKT和GLUT1蛋白的表达水平以及流式细胞技术检测小鼠血清炎症因子的含量。研究四:运用HaCaT细胞模型,分为9组,分别是空白对照组(Control)、模拟银屑病疾病组(ModelA)、疾病+PI3K/AKT通路抑制组(ModelB)、疾病+高剂量槲皮素组(ModelA+QCH)、疾病+中剂量槲皮素组(ModelA+QCM)、疾病+低剂量槲皮素组(ModelA+QCL)以及疾病+抑制+高剂量槲皮素组(ModelB+QCH)、疾病+抑制+中剂量槲皮素组(Model B+QCM)和疾病+抑制+低剂量槲皮素组(Model B+QCL),运用CCK-8法检测槲皮素对HaCaT细胞增殖的影响,流式细胞学技术检测槲皮素对HaCaT细胞凋亡的影响,并运用Western Blot技术检测各组AKT、pAKT和GLUT1蛋白的表达情况。结果研究一基于数据库构建和计算机分析,我们得到了清热凉血方的131个活性分子及483个靶标。根据Degree排名,槲皮素可能是清热凉血方中主要的活性成分,其主要靶点涉及PI3K/AKT信号通路。清热凉血方干预银屑病的生物学过程包括调节代谢、免疫等。研究二GLUT1强表达于部分棘细胞和基底细胞的细胞膜,弱表达于部分棘细胞和基底细胞的细胞核。血热型寻常型银屑病患者皮肤棘细胞和基底细胞细胞膜的GLUT1的表达水平明显高于健康对照组(P<0.001)。研究三1、皮损变化方面,模型组小鼠出现比较典型的红斑、肥厚、鳞屑等“银屑病样”改变,槲皮素组的红斑、肥厚、鳞屑较同一时间点的模型组程度轻。PASI评分方面,槲皮素组在第8天的红斑、肥厚、鳞屑评分及总分均显著低于模型组(P值均<0.05)。2、病理改变方面,模型组小鼠表现出典型的“银屑病样”改变,槲皮素各剂量组的表皮角化过度和棘层肥厚较模型组的程度轻。表皮厚度方面,模型组显著高于空白对照组(130.93±69.66 μm vs 21.81±2.84μm,P<0.001),雷公藤组、槲皮素低、中、高剂量组表皮厚度依次为 77.93±12.54 μm、71.87±12.99 μm、77.73±10.08 μm、62.33±11.41μm,且均显著低于模型组(P值均<0.05)。3、免疫组化结果显示,模型组GLUT1蛋白表达水平显著高于空白对照组(P<0.001),雷公藤组、槲皮素低、中、高剂量组GLUT1蛋白表达水平均显著低于模型组(P 值均<0.001)。4、实时荧光定量PCR结果显示,模型组小鼠皮损中AKT mRNA和GLUT1mRNA的相对表达量均显著高于空白对照组(P值均<0.001),其余各组AKT mRNA和GLUT1 mRNA相对表达量均显著低于模型组(P值均<0.001),且槲皮素低、中、高剂量组AKT mRNA和GLUT1 mRNA的相对表达量逐渐递减。5、Western Blot结果显示,模型组小鼠皮损中pAKT蛋白相对表达量比AKT蛋白的相对表达量的比值(pAKT/AKT)显著高于空白对照组(P<0.05),雷公藤组和槲皮素高剂量组的pAKT/AKT均显著低于模型组(P<0.05),槲皮素低、中剂量组的pAKT/AKT均低于模型组但差异无统计学意义(P值均>0.05)。模型组GLUT1蛋白相对表达量显著高于空白对照组(P<0.001),雷公藤组及槲皮素中、高剂量组的GLUT1蛋白相对表达量均显著低于模型组(P值均<0.05),槲皮素低剂量组GLUT1蛋白相对表达量低于模型组但无显著统计学差异(P>0.05)。同时,槲皮素低、中、高剂量组GLUT1相对表达量依次递减。6、血清炎症因子方面,模型组小鼠TNF-α、IL-17A、IL-6、IL-10水平均显著高于空白对照组(P值均<0.05),而模型组IFN-γ、IL-21、IL-22水平也均高于空白对照组,但差异无统计学意义(P值均>0.05)。同时,槲皮素高剂量组TNF-α、IL-6和IL-17A水平均显著低于模型组(P值均<0.05)。研究四1、CCK-8法结果显示槲皮素能够抑制HaCaT细胞的增殖,槲皮素在不同给药时间下对 HaCaT 细胞抑制的 IC50 分别是:24h,IC50=160.3 mM;48h,IC50=73.28 mM;72h,IC50=42.20 mM。2、细胞凋亡结果显示,Model A组细胞凋亡率显著低于空白对照组(P<0.05),Model B组细胞凋亡率显著高于空白对照组(P<0.001)。ModelA+QCH、ModelA+QCM和Model A+QCL组细胞凋亡率逐渐降低且均显著高于Model A组(P值均<0.001)。Model B+QCH、Model B+QCM细胞凋亡率逐渐降低且均显著高于Model B组(P值均<0.001),Model B+QCL组细胞凋亡率也高于Model B组,但差异无统计学意义(P>0.05)。3、Western Blot 结果显示,Model A 组 pAKT/AKT 显著高于 Control 组(P<0.01),ModelB 组 pAKT/AKT 显著低于 Model A 组(P<0.01)。ModelA 组 GLUT1 蛋白相对表达量显著高于 Control 组(P<0.001)。Model A+QCH 组、Model A+QCM 组和 Model A+QCL组pAKT/AKT逐渐升高且均显著低于Model A组(P值均<0.001)。Model A+QCH组GLUT1蛋白相对表达量显著低于Model A组(P<0.05)。Model A+QCM组和Model A+QCL组GLUT1蛋白相对表达量也均低于Model A组,但差异无统计学意义(P>0.05)。Model B+QCH组、Model B+QCM组pAKT/AKT逐渐升高且均显著低于 Model B 组(P值均<0.01)。Model B+QCH 组、Model B+QCM 组 GLUT1 蛋白相对表达量逐渐升高且均显著低于Model B组(P<0.01,P<0.05)。Model B+QCL组GLUT1蛋白相对表达量也低于Model B组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论1、清热凉血方治疗银屑病具有“多成分-多靶点”的网络作用效应。槲皮素可能是清热凉血方的主要活性成分,其发挥作用的机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。2、槲皮素可能通过调控PI3K/AKT/GLUT1信号通路发挥对银屑病的治疗作用。