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金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌之一,它不仅给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失,还对食品安全和人类健康构成威胁。目前为止,抗生素依然是治疗奶牛乳腺炎的主要手段。然而,畜牧养殖过程中抗生素的滥用,广泛引起耐药菌株特别是多重耐药菌的产生,进而导致治愈率的下降。因此,寻找抗生素替代疗法是防治奶牛乳腺炎的当务之急。益生菌能够抑制病原菌定植,被认为是一种可能的抗生素替代品。但是,由于细菌与宿主之间或细菌与细菌之间相互作用的复杂性,益生菌的抑制机制尚不明确。本研究利用健康奶牛的乳汁为菌源,筛选益生特性好的乳酸菌菌株,利用小鼠模型,评价其对奶牛乳腺炎的预防作用,为益生菌在防治奶牛乳腺炎中的应用提供理论依据。同时,本论文还研究了金黄色葡萄球菌中ISSau2插入序列的特性及乳腺炎金黄色葡萄球菌中ISSau2的序列特征。取得的主要研究结果如下:1.优良特性乳酸菌的筛选与鉴定。以健康奶牛的牛奶为菌源,利用MRS选择性培养基分离得到61株乳酸菌。通过体外抑菌试验、乳腺上皮细胞粘附试验、抑制金黄色葡萄球菌对乳腺上皮细胞的粘附试验、抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成试验、牛奶中生长试验等筛选,得到3株益生特性好的乳酸菌。这3株乳酸菌均属于魏斯式菌属,分别命名为LW1,LW2和LW3。随机选取3株益生特性差的乳酸菌,命名为LS1,LS2和LS3,一并用于后续试验的研究。2.利用小鼠乳腺模型研究乳酸菌对乳腺炎的预防作用。动物试验采用单因素完全随机设计,120只哺乳期母鼠随机分为8组:阴性对照组(乳腺仅注射PBS缓冲液)、阳性对照组(乳腺仅注射金黄色葡萄球菌)、六个处理组分别先注射乳酸菌LW1,2,3,LS1,2和3,再注射金黄色葡萄球菌。结果表明,乳腺注射乳酸菌能够显著降低乳腺组织中金黄色葡萄球菌的数量及促炎细胞因子TNFα和IL-6的表达量,从而起到预防乳腺炎的效果。其中,LW1,2和3的预防效果比LS1,2和3的预防效果更加显著。另外,还研究了乳酸菌对乳腺组织中紧密连接蛋白表达量的影响。结果显示:相比于阳性对照组,预先注射乳酸菌LW1,2和3的乳腺组织中:claudin-1基因的mRNA表达量升高,而claudin-4和7基因的mRNA表达量降低。3.研究乳酸菌预防金黄色葡萄球菌乳腺感染的分子机制。结果显示:乳酸菌LW1,2和3的基因组中含有fbpA基因,而乳酸菌LS1,2和3中不含该基因。为了研究FbpA对乳酸菌抑制金黄色葡萄球菌乳腺感染的作用,分别构建了fbpA基因的敲除菌株LW1?fbpA和FbpA表面展示菌株LW1?fbpA(FbpA)。首先,相比于LW1,LW1?fbpA对乳腺上皮细胞的粘附能力显著降低(P<0.05)。LW1?fbpA不能显著地抑制金黄色葡萄球菌对乳腺上皮细胞的粘附和侵染,而LW1?fbpA(FbpA)的抑制活性与LW1无显著差异。其次,FbpA还能够显著降低金黄色葡萄球菌生物膜的形成能力。最后,利用小鼠乳腺模型研究了FbpA对乳酸菌预防乳腺炎的影响。60只哺乳期母鼠随机分为4组:阴性对照组(乳腺仅注射金黄色葡萄球菌)、阳性对照组(LW1处理组)、LW1 fbpA处理组和LW1?fbpA(FbpA)处理组。乳酸菌经乳导管注射入乳腺内,2小时后感染金黄色葡萄球菌。结果显示:对于乳酸菌抑制金黄色葡萄球菌乳腺内定植情况而言,LW1的效果最明显,LW1?fbpA(FbpA)次之,LW1?fbpA最差。4.研究了乳腺炎金黄色葡萄球菌中ISSau2插入序列的特性。本部分试验首先验证了ISSau2编码的转座酶的结合活性,OrfAB能够特异性结合ISSau2两端的反向重复序列。其次,从164个乳腺炎金黄色葡萄球菌分离株中检测到9个含有ISSau2的菌株。通过NCBI的BLAST分析,已全基因组测序的细菌中有27株金黄色葡萄球菌中含有ISSau2。根据ISSau2序列的多样性,将发现的共37株含有ISSau2的金黄色葡萄球菌分为四组:GroupA、B、C和D。GroupA和C中的菌株全部来源于人,具有宿主特异性。GroupB中的ISSau2均为截短的ISSau21628,其中ST398菌株与GroupD中的LGA251的关系较近。GroupD中的菌株均为乳腺炎源金黄色葡萄球菌,具有组织特异性。综上所述,本研究从牛奶中成功分离筛选得到3株益生特性好的乳酸菌,其利用FbpA抑制金黄色葡萄球菌对乳腺上皮细胞的粘附和侵染,通过FbpA降低金黄色葡萄球菌生物膜的形成,以减少金黄色葡萄球菌在乳腺内的定植,从而起到减轻乳腺感染的效果。此外,还研究了ISSau2插入序列的特性以及乳腺炎金黄色葡萄球菌中ISSau2的序列特征。为进一步研究金黄色葡萄球菌乳腺炎的预防或治疗奠定基础。