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研究目的采用铁螫合剂去铁胺(DFO)、去铁胺联合三氧化二砷(AS2O3)对高致瘤性HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠进行治疗,观察上述药物对移植瘤裸鼠的治疗作用及对移植瘤组织NF-κBp65表达水平的影响,探讨其作用机制,为临床采用铁螫合剂治疗或辅助治疗白血病提供实验依据。研究方法1.采用皮下接种的方法,构建高致瘤性HL-60白血病细胞裸鼠移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为4组：50mg/kg DFO单药组、联合用药组(50mg/kg DFO+1.5 mg/kg As2O3)、3 mg/kg As2O3单药组、生理盐水对照组；于接种的当天开始给药,连续给药10天,全部采用腹腔注射,实验协议通过郑州大学第一临床学院伦理委员会批准。2.给药期间密切观察裸鼠的一般状况,裸鼠接种后的成瘤时间及移植瘤的生长特点,同时观察荷瘤裸鼠对药物的不良反应。用游标卡尺每天测量移植瘤块的最大长径(a)和短径(b),依据公式：体积=ab2/2,计算瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。3.荷瘤裸鼠在全部用药结束后24小时处死,计算移植瘤的瘤重量、抑瘤率4.荷瘤裸鼠在处死后,取其移植瘤组织做常规病理学检查,观察移植瘤组织的形态学改变；取荷瘤裸鼠骨髓,观察有无骨髓抑制和白血病细胞浸润；取荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、肾组织,观察有无病理改变及瘤转移。5.采用免疫组织化学即用型二步法(非生物素)检测各组移植瘤组织NF-κBp65的表达水平变化,运用专业图像分析系统Biosens Digital Imaging System (vl.6)进行积分光密度测定,用阳性区平均积分光密度值来表示NF-κBp65免疫组化染色阳性的表达程度。6.统计分析：采用SPSS 16.0 for Windows软件包进行统计学处理；样本数据采用均数±标准差(X±S)表示；治疗组与生理盐水对照组的移植瘤重量比较采用t检验,4组移植瘤组织免疫组化NF-κBp65表达水平比较采用单因素方差分析；统计检验均为双侧概率检验(α=0.05), P<0.05为差异有统计学意义。结果1.裸鼠接种后的成瘤情况及移植瘤的生长特点：用体外培养的高致瘤性HL-60细胞(约1×106个细胞／只)接种,于接种后第7～8天30只裸鼠全部成瘤,出现肉眼可见的瘤块,直径约0.5cm～1.0cm大小,成瘤率为100%。移植瘤生长早期仅在裸鼠接种局部皮下生长,生长迅速,呈向外膨胀性生长的特性,表现为圆形或椭圆形,随着瘤体增长逐渐成为不规则形,表面呈多个结节融合状。从外部观察这些移植瘤边界较清楚,肿瘤与皮肤无粘连,活动度可,似有包膜,表皮血管丰富,但随着移植瘤体积进行性增大,肿瘤活动度逐渐下降。当移植瘤直径长至2.0cm及其以上时,在移植瘤表皮中央出现褐色的边缘不规则的坏死灶,坏死面积随着时间延长持续扩大。该移植瘤组织较易剥离,离体后可见瘤组织有一层完整的包膜、包膜上血供丰富、切面似鱼肉状、组织松脆易碎。2.给药期间裸鼠的一般状况：给药第1天至给药第7天各组荷瘤裸鼠精神状态均良好,活动正常,反应敏捷,进食、进水正常,皮肤颜色如常,大便正常,未见明显异常反应。从给药第8天开始,随着移植瘤体积的增大,荷瘤裸鼠正常活动逐渐受到影响,行动较前迟缓,进食、进水减少。当移植瘤直径长至2.0cm及其以上时,荷瘤裸鼠逐渐呈现恶病质状态,肤色逐渐由粉色转为淡青色,且随着移植瘤的增大体重逐渐增长。给药期间,观察到As2O3单药组有2只裸鼠出现腹水,对照组有1只裸鼠出现眼部转移瘤,除此之外,各治疗组荷瘤裸鼠一般状况与对照组相比无明显差异。3.不同用药组移植瘤体积增长情况：随着时间的延长,荷瘤裸鼠移植瘤体积越来越大。各治疗组移植瘤体积增长速度均较对照组慢,其中以DFO联合As2O3组移植瘤体积增长最慢,其次为As2O3单药组和DFO单药组。给药第1天至给药第5天,所有裸鼠无移植瘤生长,从给药第6天开始,各治疗组的移植瘤平均体积均小于生理盐水对照组,且随着给药时间的延长,各治疗组与对照组移植瘤平均体积的差值进一步扩大。到第11天时,生理盐水对照组移植瘤平均体积最大,其次是DFO单药组,再次是As2O3单药组,而DFO联合As2O3用药组的移植瘤平均体积最小,说明不同用药组对高致瘤HL-60白血病细胞裸鼠异种移植瘤体积随时间变化的趋势有影响。4.DFO单药组和As2O3单药组对高致瘤性HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的抑瘤率分别为2.56%和10.67%,移植瘤重量分别为(2.55±0.82)g和(2.34±0.79)g,与生理盐水对照组相比较,差异均无统计学意义(分别为F=1.290,P=0.866 >0.05和F=1.714,P=0.474>0.05):DFO联合As2O3用药组对高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的抑瘤率为25.49%,移植瘤重量为(1.95±0.39)g,与生理盐水对照组相比较,明显低于生理盐水对照组,差异有统计学意义(F=0.028,P=0.019<0.05),提示DFO联合As2O3用药对HL-60高致瘤细胞裸鼠异种移植瘤的生长具有抑制作用,DFO联合As2O3在抑制高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的生长上具有协同作用。5.荷瘤裸鼠在处死后,肉眼观察各组移植瘤组织,可见出血坏死区,有的瘤块表面可见黑色痂样改变。光镜下可见,对照组瘤细胞分布密集,瘤细胞圆形或椭圆形,细胞胞体较大,大小基本一致,明显异型,核大而深染,胞浆量少,呈嗜碱性,可见个别凋亡细胞及凋亡小体,内有散在的局灶性细胞坏死区：各治疗组移植瘤组织中瘤细胞数目明显较生理盐水对照组减少,细胞体积变小,核深染,有的细胞固缩,有的仅存胞核,可见不规则坏死、出血,呈片状的嗜伊红结构,凋亡细胞和凋亡小体小片状分布,其中以DFO联合As2O3用药组较DFO单药组和As2O3单药组显著。6.荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾病理组织学检查结果显示：在显微镜下观察可见,每只荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、肾组织,结构完整,除充血程度不同外,均无明显的病理改变,未见HL-60白血病细胞转移。7.荷瘤裸鼠骨髓病理组织学检查结果显示：4组均可见有核细胞增生活跃,粒红比例正常,末见明显的骨髓抑制和HL-60白血病细胞浸润。8.免疫组织化学PowerVisionTM二步法检测移植瘤组织NF-κBp65的表达,统计学结果显示：DFO单药组,As2O3单药组与DFO联合As2O3用药组3个治疗组的平均积分光密度值均低于生理盐水对照组,与生理盐水对照组比较均有统计学差异(P<0.05)；且NF-κBp65表达的积分光密度值：生理盐水对照组>As2O3单药组>DFO单药组>DFO联合As2O3用药组。4组两两相互比较差异均有统计学意义(P<0.05)。提示DFO和As2O3都可降低高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤组织的NF-κBp65表达,二者联合降低移植瘤组织NF-κBp65表达的作用更强。结论1.采用高致瘤性HL-60白血病细胞(1×106个细胞／只)在裸鼠皮下接种,可成功建立移植瘤动物模型,接种后7～8天均能形成直径约0.5cm～1.0cm大小的移植瘤,成瘤率达100%,且成瘤后瘤体生长迅速。2.DFO和As2O3单药应用均可抑制高致瘤HL-60白血病细胞裸鼠异种移植瘤的生长,二者联合作用显著。3.DFO联合As2O3应用荷瘤裸鼠能较好耐受,DFO可降低As2O3用量,促进其杀伤肿瘤作用,且可降低As2O3毒副作用。4.DFO和As2O3均可降低高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤组织的NF-κBp65的表达水平,二者联合降低移植瘤组织NF-κBp65表达的作用更明显。