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研究背景:肺癌是一个非常严重的公共卫生问题,而且是全世界最常见的癌症。尽管治疗方法和检测手段得到了不断发展和提升,但临床肺癌患者的预后仍然较差,五年生存率仅为20%。缺乏早期诊断和肿瘤远端转移仍然是成功治疗癌症的主要障碍,也是肺癌患者死亡的重要原因。因此,鉴定新的诊断和预后标志物以及确定肺癌发生和发展的潜在机制对于改善肺癌患者的生存至关重要。C2结构域是独立折叠的模块,约130个残基,存在于多种真核蛋白中。该结构域最初被认定为细胞Ca2+效应子,并且与囊泡运输信号传递有关。已有一些研究表明,多种蛋白质的C2结构域在细胞信号转导、蛋白相互作用和肿瘤发生发展中也起关键作用。例如,Smurf1的C2结构域直接与PIPKIγ的激酶结构域相互作用并调节肺癌细胞的生长和迁移。Myoferlin参与调节细胞脂质代谢和促进三阴性乳腺癌转移。NEDD4L在结直肠癌中表达下调,并参与抑制Wnt信号通路。我们前期通过全基因组表达筛选,首次发现TC2N在肺癌组织中高表达,推测其与肺癌发生发展有关。TC2N是含C2结构域的蛋白,属于羧基末端型（C型）串联C2蛋白家族,其蛋白质结构特点表明该蛋白可能在肿瘤发生发展中具有重要的作用。但是,目前关于该基因的功能未知,所以我们拟进一步探索TC2N在癌症发生和发展中的作用及分子机理,探讨其在肺癌中的临床意义。内容:1.肺癌组织和癌旁正常组织中TC2N表达的检测。通过公共数据库Oncomine分析TC2N在肺肿瘤组织和非肿瘤组织之间的mRNA表达情况。通过IHC对TC2N蛋白在人肺肿瘤标本和配对癌旁组织标本之间的表达情况进行验证。2.TC2N在肺癌中的临床特征及预后意义分析。通过两个公共数据集GSE3141和GSE31210分析TC2N表达的预后意义。并进一步通过使用含有272例人肺肿瘤组织和265例相邻癌旁组织的组织芯片评估TC2N的临床意义和预后价值。3.评估TC2N在肺癌细胞中的生物学特性。通过MTS、集落形成、细胞周期、细胞凋亡、细胞伤口愈合、Transwell实验分析体外差异表达TC2N对肺癌细胞增殖、克隆形成、周期、凋亡、迁移和侵袭的影响。通过裸鼠异种移植模型分析体内差异表达TC2N对肿瘤生长和转移的影响。4.TC2N在肺癌细胞中的生物学功能分子机制研究。通过生物信息学分析TC2N调控肺癌肿瘤生长和转移表型的下游信号通路,并通过荧光素酶报告实验和WB实验进行验证。通过WB、Co-IP和免疫荧光试验阐明TC2N参与调控p53和NF-κB信号通路的具体分子机制。结果:1.TC2N高表达与人肺癌的进展和不良预后相关。（1）我们首先通过分析已发表的Oncomine数据集中的肺癌表达谱数据来评估肿瘤和非肿瘤组织之间TC2N的表达。根据Oncomine的数据,我们发现肺癌组织中TC2N mRNA的表达显著高于正常肺组织。随后,分析了含272个肺癌样本和265个匹配的癌旁样本组织芯片中TC2N的蛋白表达,结果表明与正常组织相比,TC2N的蛋白质表达在肿瘤组织中显著上调。（2）分析TC2N表达与肺癌病人的临床病理参数时发现,TC2N蛋白表达与临床分期（P=0.006）,组织学分级（P<0.001）和淋巴结转移（N）显著相关（P<0.001）。（3）为了进一步评估TC2N在肺癌中的预后意义,我们进行了单变量Kaplan-Meier分析和多变量Cox比例风险回归分析,以评估TC2N表达对肺癌预后的影响。结果显示,TC2N高表达与肺癌患者的不良预后有关,并且是肺癌患者生存的独立预后因素。进一步通过Cox多元回归分析表明,TC2N高表达是晚期和中低级别肺癌病人的独立预后标志物,但不是早期和高级别肺癌病人的独立预后标志物。2.TC2N在体外和体内促进肺肿瘤生长和转移。（1）为了探究TC2N在肺癌细胞中的生物学功能,我们评估了TC2N差异表达后肺癌细胞的增殖、集落形成、细胞周期、细胞凋亡、迁移和侵袭变化。我们观察到TC2N的敲减增加了细胞凋亡并抑制了肺癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭。相反,TC2N的过表达则减少了细胞凋亡,促进了肺癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭,表明TC2N是一个候选的癌基因。（2）对TC2N过表达在体内对肿瘤生长和远处转移的影响进行评价的结果表明,TC2N高表达的会促进肿瘤生长并明显增加和增大肿瘤细胞在肺和肝脏处形成的转移灶的数量及大小。3.TC2N通过诱导Cdk5降解或阻止Cdk5与p53的相互作用以抑制Cdk5诱导的p53磷酸化抑制p53信号通路从而促进细胞增殖,抑制肺癌细胞凋亡。（1）基于来自TCGA的数据,我们对人肺癌数据集进行了GO分析并发现TC2N的共表达基因富集于p53信号通路。为明确TC2N是否参与调控p53信号通路,我们在差异表达TC2N后检测了p53信号通路活性及其下游靶基因表达,结果表明TC2N显著抑制p53信号通路活性并改变了p53靶基因的表达,但对p53本身的表达没有明显改变。（2）机制研究明,TC2N抑制Cdk5介导的p53磷酸化导致p53信号通路抑制从而促进肺癌细胞增殖并抑制凋亡。并且TC2N对Cdk5的抑制是多层次的,既可以通过泛素化蛋白酶体途径促进Cdk5蛋白质降解,也可以直接与p53相互作用以阻断Cdk5与p53的相互作用。4.TC2N通过促进IκB的磷酸化以增加NF-κB向细胞核的易位激活NF-κB信号通路从而促进肺癌细胞的迁移和侵袭。（1）基于来自TCGA的数据,我们对人肺癌数据集进行了GSEA分析并发现TC2N表达与NF-κB信号通路相关。为了明确TC2N是否参与调控NF-κB信号通路,我们检测了TC2N差异表达后NF-κB信号通路活性及其下游靶基因的表达变化,结果表明TC2N显著上调NF-κB信号通路活性并激活其下游靶基因的表达。（2）随后,我们证明TC2N可以促进NF-κB进入细胞核激活NF-κB信号通路从而促进肺癌细胞迁移和侵袭。由于IκB是NF-κB信号通路的一个关键的抑制分子,其通过限制NF-κB迁移进入细胞核和掩盖其DNA结合域和核定位结构域来抑制NF-κB信号通路,所以我们想进一步探究是否TC2N会促进IκB的磷酸化降解。的确,随后的研究结果表明过表达TC2N显著地增强了肺癌细胞中IκB的磷酸化水平,并降低了IκB的总蛋白水平。结论:TC2N是一个新的癌基因,其高表达促进肿瘤生长和转移并且与肺癌病人的预后不良相关。TC2N可以抑制p53信号以促进细胞增殖并抑制细胞凋亡;TC2N可以激活NF-κB信号以加速肿瘤转移。