Synaptotagmin (Syt)是一个广泛存在于神经和内分泌细胞内的分泌囊泡上的蛋白质家族。作为钙离子依赖性神经递质和激素释放过程中的钙离子感受器,Syt触发和调节囊泡与靶膜的融合过程,参与对神经递质和激素释放过程的严格调控,也可能参与对细胞的蛋白质与膜转运的调节。该家族在哺乳动物中有16种以上的亚型,它们在细胞内有各自不同的定位,并发挥不同的调节功能。通过亚型间以及亚型和效应物分子间的相互作用,特别是对钙离子的结合,Syt对胞吐过程进行着有效地调控。在膜融合的事件中,大部分是需要钙离子的存在的。Syt可能是一种在较为宽广范围的膜融合事件中广泛分布的钙离子敏感的融合机制中的调控蛋白。本课题以一种鼠源性传代促性腺激素释放细胞系LβT2细胞为研究对象深入研究Syt在细胞分泌中的分子调控机制。垂体促性腺激素释放细胞分泌促性腺激素,在生殖系统中起到中心调节的作用,其分泌活动的异常会直接影响到生长发育和性功能成熟等。对分泌的机制以及它的调控机制的研究,对于进一步正确认识分泌现象的本质,对于那些与分泌有关的疾病的治疗及相关药物的开发都有着重要的现实意义。Syt家族是多亚型的蛋白家族,因此需要应用一种高效筛选方法,研究每种Syt在细胞分泌中的分子调控机制。本实验应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,在RNA的转录后阶段将Syt基因的表达进行沉默,形成knockdown的效果,并在此基础上对沉默的Syt基因进行功能变化的检测。实验使用短暂(～1.5 ms)强紫外光裂解光敏感的Ca2+螯合物NP-EGTA,使胞浆内的钙离子浓度[Ca2+]i快速(<2ms)升高到～20微摩尔,刺激细胞分泌,并同时测量膜电容和钙离子浓度。在本研究课题中,我们将Syt IV和Syt VII分别与EGFP (Enhanced green fluorescent protein,增强绿色荧光蛋白)融合,构建了pEGFP-N1-Syt IV和pEGFP-N1-Syt VII表达载体。采用全内反射成像技术,详细地研究各种Syt亚型的细胞内定位。实验结果表明(1)通过选择合适的目标序列,经shRNA沉默的细胞中Syt I、IV、VII、IX的表达量为野生型细胞表达量的27%、36%、32%和25%。(2)Syt I蛋白表达沉默对分泌的快速簇发相(Fast burst),慢速簇发相(Slow burst)和持续相(Sustained)的大小都没有显著影响;Syt VII蛋白表达沉默对分泌的快速簇发相和持续相的幅度都没有显著影响,但选择性地减少了慢速簇发相的幅度;Syt IX蛋白表达沉默显著性地减少快速簇发相和持续相,但对慢速簇发相没有显著的影响。(3)Syt IX (本实验室已有质粒)标记的囊泡与用NPY-DsRed标记的致密核心大囊泡共存,Syt VII标记的囊泡与用CD63-TDimer2标记的溶酶体共存。从以上实验结果,我们推测分泌的快速簇发相和慢速簇发相可能由不同的Syt介导;由于Syt VII定位于溶酶体上,因此分泌的慢速簇发相也有可能部分地由分泌性溶酶体的膜融合构成。Syt IX的表达沉默对快速簇发相和持续相的显著抑制作用表明它可能参与了致密核心大囊泡的激活过程。因此推测在LβT2细胞中:Syt IX是囊泡的Ca2+感受器;可能参与了囊泡的激活过程;减少了囊泡的去激活,维持了快速释放囊泡库的大小。