论文部分内容阅读
旋毛虫病(Trichinellosis)是一种常见的重要食源性人畜共患线虫病,主要由于生食或半生食含有旋毛虫幼虫包囊的猪肉或者其他温血动物肉类而感染。旋毛虫的排泄分泌抗原(excretory-secretory antigen,ES抗原)由旋毛虫虫体在宿主体内分泌排泄产生,作为抗原物质在其整个生活周期对宿主的入侵和持续感染中起着关键作用。旋毛虫HSP70与所有生物热休克蛋白一样是最高度保守的蛋白,可以通过与巨噬细胞和树突状细胞(dendrtic cells,DCs)的相互作用参与逃避宿主免疫。但旋毛虫ES抗原和HSP70对活化或抑制机体免疫的作用机制尚不明确。本研究以小鼠树突状细胞DC2.4为模型,观察体外情况下旋毛虫ES抗原和旋毛虫重组HSP70对DC2.4的活化能力,再以ES抗原反复刺激和经ES抗原预刺激后接受LPS/ES抗原的刺激以及HSP70反复刺激和经HSP70预刺激后接受Pam3csk4/HSP70的刺激,分别对表面标志分子CD80/CD86进行流式细胞术观察,TLR4/TLR2的表达水平和信号通路转录因子NF-κB和AP-1mRNA定量检测,相关蛋白和细胞因子水平分别进行Westen-blot和ELISA测定。根据GenBank中登录的TLR2、TLR4、NF-κB、AP-1和管家基因(GAPDH)等序列设计并合成荧光引物,建立荧光定量PCR检测方法。CCK-8细胞增殖力结果表明,ES抗原浓度和HSP70浓度在25μg/ml以内不会影响DCs的活力。当ES抗原浓度和作用时间不同时,DCs的TLR4mRNA表达量不同,在一定范围内成剂量和时间效应,随浓度和时间的增加TLR4mRNA表达量有减少的趋势.本研究选择15μg/ml和12h分别为工作浓度和时间.HSP70对DCs增殖活力的影响研究表明TLR2mRNA表达量也有相似的效应,同理选择5μg/ml和12h。DCs的免疫调节研究表明,分别受ES抗原和LPS(TLR4激动剂)活化后表面共刺激分子CD80/CD86水平明显上调,TLR4.NF-κB和AP-1mRNA表达量均急剧增加,NF-κB途径的MyD88、NF-κB和MAPK途径的c-jun、p38蛋白磷酸化水平表达明显升高,促炎性细胞因子IL-6、IL-12、NO和TNF-a水平明显升高同时抗炎性细胞因子IL-10水平也相应显著升高。活化后经LPS/ES抗原再刺激,与DCs活化时相比,表面共刺激分子CD80/CD86水平下调,TLR4、NF-κB和AP-1mRNA表达量均显著较少,MyD88.NF-κB、c-jun、p38蛋白磷酸化表水平明显降低,促炎性细胞因子IL-6.IL-12、NO和TNF-a水平及抗炎性细胞因子IL-10水平均显著降低。HSP70诱导DCs的免疫调节研究显示,HSP70和Pam3csk4(TLR2激动剂)活化后其表面共刺激分子CD80/CD86水平明显上调,TLR2、NF-κB和AP-1mRNA表达量明显升高，MyD88.NF-κB、c-jun和p38磷酸化水平明显升高,促炎性细胞因子IL-6、IL-12、NO和TNF-a水平明显升高同时抗炎性细胞因子IL-10水平也相应显著升高。活化后经Pam3csk4/HSP70再刺激,与DCs活化时相比,CD80/CD86水平下调,TLR2、NF-κB和AP-1mRNA表达量均显著较少,MyD88、NF-κB、c-jun、p38蛋白磷酸化明显降低,IL-6、IL-12、NO和TNF-a水平及IL-10水平均显著降低。以上研究结果证实,一定剂量和时间作用下,旋毛虫ES抗原和重组HSP70均能通过上调共刺激分子CD80/CD86和诱导细胞表面受体TLR4及TLR2的表达从而启动下游NF-κB和MAPK途径关键蛋白的表达并诱发炎性细胞因子的分泌,活化后的DCs再经ES抗原或HSP70作用会下调共刺激分子CD80/CD86表达,抑制TLR4及TLR2的表达及其下游通路,产生免疫耐受作用,表明ES抗原或HSP70的持续性刺激或者前述多PPRs的交叉刺激都可能通过TLR2/TLR4介导的NF-κB和MAPK途径诱导DCs处于类似于内毒素诱导的免疫耐受状态。这不仅为研究蠕虫的免疫调节机制成功提供了体外模型,也为临床治疗旋毛虫病及研制有效的疫苗提供新的依据和思路。