论文部分内容阅读
生物表面活性剂,除具有表／界面活性,其独有的低毒或无毒性和环境相容性等特性,使其在石油工业、医药、化妆品、食品加工等领域开始逐步替代化学表面活性剂。脂肽表面活性剂地衣素(lichenysin)具有较强的表面活性、溶血活性和离子螯合性,但由于其得率低、生产成本高,限制了它的大规模工业化生产与应用推广。为提高lichenysin的发酵产率、降低生产成本,本研究以实验室前期选育的地衣芽胞杆菌WX-02为研究对象,考察不同启动子对lichenysin生物合成的影响；构建lichenysin高产工程菌株,并对其发酵工艺进行优化,提高lichenysin产量。同时,在发现地衣素诱导WX-02高产聚γ-谷氨酸(poly-y-glutamic acid,以下简称γ-PGA)的基础上,利用代谢通量分析方法,结合关键酶基因表达差异分析,考察了lichenysin合成量对地衣芽胞杆菌y-PGA合成的代谢调节,并探讨了lichenysin促进γ-PGA合成的可能机制。主要结论如下：1.地衣芽胞杆菌WX-02表面活性物质地衣素的分离纯化及结构分析结合GC-MS和电喷雾质谱(ESI-MS),解析地衣芽胞杆菌WX-02产生的脂肽化合物的结构：它是由[M+H]+m/z分别为993.6、1007.9、1021.9、1035.9和10499的lichenysin同系物组成, 其肽链氨基酸基本序列为Glnl-Leu2-Leu3-Val4-Asp5-Leu6-Ile7:碳链长度在C12至C16之间。其中,[M+H]+m/z1007.9,1035.9这2种分子结构组分分别由2个同分异构体组成,其碳链中第7位氨基酸为11e或Val。2.地衣素高产地衣芽胞杆菌工程菌株的构建通过同源重组,将来源于枯草芽胞杆菌168的启动子P43(组成型)、启动子Psrf(surfactin合成操纵子启动子)和地衣芽胞杆菌WX-02的启动子Pxyt(木糖诱导型),分别替代地衣芽胞杆菌WX-02中lichenysin合成操纵子的原始启动子Plch,构建lichenysin工程菌地衣芽胞杆菌WX02-P431ch、WX02-Psrflch和WX02-Pxyllch。以无lichenysin合成能力的缺失株WX02-ΔlchAC作负对照,对比lichenysin工程菌和原始菌WX-02的lichenysin合成量,结果表明地衣芽胞杆菌WX02-P431ch和WX02-Psrflch的lichenysin最高产量分别为225 mg/L和779 mg/L,较原始菌分别提高了0.9倍和5.5倍。而WX02-Pxyllch的lichenysin产量仅为45 mg/L,较原始菌降低了63%。通过qRT-PCR检测重组菌与原始菌的lichenysin合成酶LchAA编码基因lchAA的转录水平,结果显示lchAA的表达量与菌株的lichenysin合成量变化趋势一致,表明lichenysin生物合成操纵子在不同强度的启动子控制下发生差异性表达,进而影响lichenysin的合成量。通过比较重组菌与原始菌的群游和生物被膜形成能力,进一步验证了工程菌的lichenysin生产能力。3.地衣素高产工程菌WX02-Psrflch的摇瓶发酵工艺优化利用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究各种营养成分和环境因素对lichenysin高产工程菌WX02-Psrflch摇瓶发酵生产lichenysin的影响。结果表明,葡萄糖是lichenysin合成的最适碳源,无机氮源比有机氮源更有利于lichenysin的合成,Na2HPO4-KH2PO4缓冲体系对WX02-Psrflch发酵生产lichenysin十分重要。优化后的培养基组成为：30 g/L glucose,5 g/L NH4NO3,60 mmol/L KH2PO4,80 mmol/L Na2HPO4,0.4 mmol/L FeSO4·7H2O,0.2 mmol/L MnSO4-H2O,0.8 mmol/L MgSO4·7H2O,7 nmol/L CaCl2,4 Mmol/LNa2-EDTA;最佳摇瓶发酵条件为：培养温度37℃、种龄8 h、接种量(v/v)3%、装液量为30 mL/250 mL三角瓶。在优化的发酵工艺下,WX02-Psrflch的lichenysin产量可达到2149 mg/L,较原始菌WX-02提高了16.8倍。4.地衣素对地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸合成的影响考察外源添加lichenysin对原始菌WX-02及缺失株WX02-ΔlchAC发酵生产γ-PGA的影响,发现一定浓度的lichenysin促进WX-02和WX02-ΔlchAC合成γ-PGA。比较lichenysin工程菌和原始菌的γ-PGA生产水平,结果表明细菌自身的lichenysin合成能力显著影响其γ-PGA发酵水平,γ-PGA产量与lichenysin合成量正相关。以原始菌(WX-02)、lichenysin高产株(WX02-Psrflch)和lichenysin不产工程菌(WX02-MchAC)作为研究对象进行γ-PGA发酵,发现WX02-Psrflch的γ-PGA最大产量达到43.6 g/L,分别是WX-02和WX02-ΔlchAC的1.2倍和1.5倍。分析三株菌的γ-PGA发酵过程曲线,发现在γ-PGA合成过程中,地衣素可能通过增强细菌对底物和储备碳源乙偶姻的利用能力,削弱对发酵副产物的合成能力,从而促进菌体生长及y-PGA合成。代谢流分析结果表明,lichenysin能促使细胞内的代谢流发生迁移,减弱了溢流代谢途径的代谢通量,增强能量合成和三羧酸循环(TCA循环)的代谢通量,使更多的碳流流入谷氨酸合成途径,进而推动y-PGA的合成。进一步考察地衣素对γ-PGA合成代谢途径中关键酶基因的转录水平的影响,qRT-PCR结果显示：在γ-PGA合成代谢途径中,关键酶基因的表达量与代谢通量变化趋势大致相符,这也从基因表达水平验证了代谢网络中关键节点处的流量分配变化。此外,通过比较分析lichenysin合成与γ-PGA生物合成相关调控蛋白基因的表达水平发现,与原始菌WX-02相比,在lichenysin高产菌中与lichenysin和γ-PGA合成相关的正调控因子如ComA、DegQ和DegU等的转录量显著提高,因而促进了γ-PGA合成酶基因pgsB的表达.上述结果表明,在地衣芽胞杆菌lichenysin工程菌株中lichenysin的合成受到启动子强度的作用。而在γ-PGA发酵过程中,lichenysin通过影响γ-PGA合成代谢途径的代谢通量和关键酶基因的表达,以及γ-PGA生物合成相关调控蛋白基因的转录水平,进而影响地衣芽胞杆菌的γ-PGA合成能力。