目的：　　 RACK1(receptorfor activated Ckinase 1)为有活性的蛋白激酶C受体。蛋白激酶C的激活依赖于RACK1蛋白。RACK1的功能并不局限于PKC通路,作为支架蛋白及适应蛋白,通过不同的WD40位点,与细胞内多种蛋白相互作用,参与细胞功能调控。微小染色体维持蛋白复合体(MCM)为DNA复制执照系统成员之一,调控真核细胞的DNA复制,保证DNA复制在一个细胞周期中只有一次。MCM7为该复合体的重要成分,并对维持MCM复合体的螺旋酶活性有重要意义,在控制DNA复制的过程中起关键作用,与细胞周期调控、转录、细胞增殖密切相关。　　 我们前期通过酵母双杂交的筛选获得了与MCM7相互作用的蛋白,分别是张力蛋白(tensin),调宁蛋白(calponinl),纽带蛋白(vinculin),属于细胞膜骨架的内收蛋白1(adducin1),层粘连蛋白1(1aminin1)等。Rack1是MCM7相互作用蛋白。蛋白激酶C激活的特征是由胞浆转至胞膜或细胞骨架,这一转位依赖于RACK1蛋白。RACK1缺乏的细胞运动能力减弱。RACK1促进细胞增殖。MCM7与RACK1蛋白结合,RACK1磷酸化MCM7,促进细胞周期进展。　　 有报道:RACK1抑制src激酶活性,在G1期抑制细胞生长、促进凋亡;相反:乳腺癌中RACK1与细胞增殖密切相关,其高表达预后差。因此RACK1与MCM7间作用尚需进一步研究。　　 本文应用rt-pcr、western-blot、免疫组化实验检测MCM7与RACK1在肺癌中表达,并探讨二者与肺癌临床病理因素间关系。　　 材料与方法：　　 1、标本来源　　 (1)肺癌组织　　 收集中国医科大学第一附属医院病理科2010年3月至2011年12月手术切除的标本,包括32例原发灶及相应正常肺组织标本。　　 (2)石蜡切片　　 购买上海芯超生物科技有限公司组织芯片肺癌120点OD-CT-DgLug01-007、肺腺癌150点OD-CT-RsLug01-008、肺鳞癌150点OD-CT-RsLug01-009含有详细病理资料及预后资料。　　 2、试剂　　 mousemonoclonalanti-RACK1购自BD公司,mousemonoclonalanti-MCM7购自SantaCruz公司。S-P免疫组化试剂盒(kit-9701)购自福州迈新生物科技开发有限公司,RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。　　 3、实验方法　　 (1)RT-PCR　　 收集组织标本,提取RNA,RNA定量。反转录,PCR。电泳后经发光。RNA带经BiolmagingSystems(UVP,CA,USA)采集后进行灰度值测定,目的RNA灰度值与内对照β-actin进行标准化后即为其相对RNA定量。　　 (2)Westernblot　　 收集组织标本,提取总蛋白,蛋白定量。电泳后将蛋白转印到PVDF膜上,然后用5%BSA封闭,4℃一抗过夜,二抗37℃孵育2小时后ECL发光。蛋白条带经BiolmagingSystems(UVP,CA,USA)采集后进行灰度值测定,目的蛋白灰度值与内对照β-actin进行标准化后即为其相对蛋白定量。　　 (3)免疫组织化学(S-P)法　　 切片常规脱蜡、水化,3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶,高温高压热修复,柠檬酸盐抗原修复液2min,蒸馏水冲洗5×3遍、PBS冲洗5×3遍,非免疫动物血清室温孵育10min,以封闭特异性位点,去血清加一抗MCM7(1:100)RACK1(1:200),4℃于冰箱孵育过夜,蒸馏水冲洗、PBS冲洗5×3遍。加即用型广谱试剂盒C液(鼠兔共用二抗)室温孵育20min。蒸馏水冲洗、PBS冲洗5’×3遍,加即用型广谱试剂盒D液,室温20min。蒸馏水冲洗、PBS冲洗5×3遍,DAB显色。苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。　　 结果评定标准,以肺癌细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达,结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分结果评定标准。MCM7、RACK1阳性表达根据阳性细胞百分率和染色程度进行半定量结果判定:无阳性细胞记0分,阳性细胞百分率≤50%记1分,51%-7596记2分,≥75%记3分:胞浆和/或细胞核基本不着色记0分,染色棕黄记1分,染色棕色记2分,染色褐色记3分。每张切片的阳性细胞百分率得分和染色程度等分两项相加作为最后得分。总分0-1分记阴性(-),2-3分记为弱阳性(+),4-5分记为(++),6分以上记为强阳性(+++);以阴性至弱阳性为低表达,阳性至强阳性为高表达。　　 4、统计学分析　　 数据应用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析,数据比较采用单因素方差分析、相关性分析、X2检验、Kaplan-Meier法等。P＜0.05为差异具有统计学意义。　　 结果：　　 1、MCM7与RACK1在肺癌和癌旁组织中的表达　　 对30例新鲜的肿癌和癌旁组织进行WesternBlot分析,结果显示MCM7与RACK1在肺癌和癌旁组织中均有表达,分子量MCM7约89kDa、RACK1约35kDa,但在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01)。　　 对30例新鲜的肺癌和癌旁组织进行RT-PCR分析,结果显示MCM7与RACK1在肺癌和癌旁组织中均有表达,分子量MCM7约345bp、RACK1约400bp,但在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01)。　　 对(购自上海芯超生物科技有限公司的)肺鳞癌、肺腺癌组织芯片应用s-p法进行免疫组织化学染色,结果显示MCM7与RACK1在肺癌和癌旁组织中均有表达,MCM7主要是细胞核表达,RACK1是细胞膜和浆表达,二者在肺癌组织中的表达均明显高于癌旁组织(P＜0.01)。　　 2、MCM7与RACK1二者在肺癌中表达与临床病理因素间关系　　 免疫组化统计学分析显示,MCM7蛋白表达和RACK1蛋白表达呈正相关(r=0.427,P=0.026)。两者表达水平均与肺癌的病理分级(P=0.032,P=0.035)、淋巴结转移P=0.041,P=0.047)、组织分类(P=0.032),和临床AJCC(P=0.043,P=0.036)相关。二者与患者年龄(P=0.545,P=0.606)无关。MCM7与性别(P=0.036)相关,而RACK1与性别(P=0.587)无明显相关性。　　 3、MCM7与RACK1高表达患者生存时间缩短　　 应用Kaplan-Meier法分析MCM7、RACK1蛋白表达与各类型肺癌患者生存时间(P=0.006,P=0.002,Log-rank检验)的关系,显示MCM7、RACK1高表达组(4-6分)生存时间明显低于低表达组(0-3分)。　　 4、MCM7与RACK1在肺癌中的表达正相关　　 对MCM7与RACK1的表达进行Pearson相关性分析,Western(r=0.569,P=0.002),RT-PCR(r=0.379,P=0.047)结果具有相关性。　　 对肺癌组织芯片MCM7与RACK1蛋白表达应用Spearman等级相关性分析,结果显示二者具有相关性(r=0.427,P=0.026)。　　 结论：　　 1、MCM7与RACK1在肺癌中表达高于癌旁组织。　　 2、MCM7与RACK1在肺癌中的表达与组织学分级、TNM分期、淋巴结转移和生存时间相关。　　 3、MCM7与RACK1在肺癌中的表达具有正相关性。　　 4、MCM7与RACK1有可能作为检测肺癌癌细胞的增殖状态、以其为靶向进行临床治疗的重要指标。