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猪繁殖与呼吸综合征是目前危害全球养猪业最严重的病毒性传染病之一。自1987年首次在美国出现以来,一直是世界养猪业防控的难题。而在我国自2006年6月份以来高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在湖北、湖南、江西、安徽等地的出现和流行更是给我国养猪业造成了难以估量的损失。准确、可靠的检测技术和安全、高效的疫苗是预防和控制PRRS的关键,也是目前猪病研究的热点。本文用原核表达系统对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因进行高效可溶性表达,并制备了抗猪繁殖与呼吸综合征N蛋白单克隆抗体,以该单克隆抗体作为包被抗体建立了双抗体夹心ELISA检测方法,并进行了ELISA试剂盒的研制以期建立一套准确、可靠、方便、快捷的检测技术。另外,本研究还构建了分别以伪狂犬病毒和杆状病毒为载体的基因工程疫苗,并对疫苗的免疫效力进行了研究。1、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) WUH1株的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR方法扩增获得编码核衣壳蛋白(N)的ORF7基因,将ORF7基因克隆至pGEM-T easy载体上,获得含有ORF7基因的阳性重组质粒pGEM-T-N。经测序证实无碱基误配后,再将ORF7基因亚克隆至原核表达载体pET-30a中,获得重组表达质粒pET-30a-N,转化E.coli BL21 (DE3)细胞,IPTG诱导后N蛋白得到表达,经SDS-PAGE电泳和Western Blotting检测证实N蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达,并能与PRRSV抗体阳性猪血清反应,具有很好的免疫学活性。2、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备以纯化后的猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH1株ORF7基因的原核表达产物免疫Balb/c小鼠,将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合。分别使用重组N蛋白和由Marc-145细胞扩增的猪繁殖与呼吸综合征病毒作为抗原建立间接ELISA方法进行双重筛选,通过有限稀释法进行克隆。最后发现N3H12和N4D2效价显着高于其它杂交瘤细胞株,故将N3H12和N4D2用于后续研究。将N3H12和N4D2两株细胞分别接种Balb/c小鼠,制备腹水,结果腹水抗体的的效价分别为100×214和100×215。3、猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立及其应用以由Marc-145细胞扩增的PRRSV WUH1株、CH-1a株和Marc-145细胞分别作为抗原,以两株纯化的单抗互为包被抗体和酶标记物进行双抗夹心ELISA检测,结果以单抗N4D2株作为包被抗体、辣根过氧化物酶标记的单抗N3H12株作为酶标记物的结果明显优于以单抗N3H12株作为包被抗体、辣根过氧化物酶标记的单抗N4D2株作为酶标记物的检测结果。通过方阵滴定确定单抗的最佳包被浓度为21μg/mL,酶标记物的最佳工作浓度为1：1000。试验的最佳反应条件为：2～8℃包被14h,37℃封闭1h,抗原与包被单抗37℃作用1h,酶标记物与抗原的最佳反应时间为37℃ 1h,底物的最佳反应时间为15min。建立了双抗体夹心ELISA诊断方法,并对其进行了敏感性、特异性、重复性试验。敏感性试验的结果为该方法对重组N蛋白的最低检测量可达6.8ng,对PRRSV的最低检测量约为150 TCID50,而RT-PCR试剂盒对PRRSV的最低检测量约为20TCID50,说明该方法具有良好的敏感性；特异性试验表明除了阳性对照外,其它几种病毒和阴性样品检测均为阴性：重复性试验表明该方法的批间重复性和批内重复性都很好；用猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原检测试剂盒和RT-PCR检测试剂盒检测127份临床采集的血清样品,两种试剂盒的阳性符合率为84.6%,阴性符合率为86.4%,总符合率为85.8%。4、伪狂犬病毒为载体的PRRSV重组基因工程疫苗的研究在原有重组病毒rPRV-GP5m-M(共表达GP5m和M)的gG位点插入高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH1株的主要免疫原性基因ORF5和猪圆环病毒2型(PCV-2)修饰型ORF2 (ORF2m)基因的表达盒即CMV-ORF5-polyA和CMV-ORF2m-polyA构建重组病毒rPRV-PRRSV-2,另外在重组病毒rPRV-GP5m-M(共表达GP5m和M)的gG位点插入CMV-SynORF5-polyA(表达优化后的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因),CMV-ORF4-polyA(表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH1株ORF4基因)和CMV-ORF5-ORF2m-polyA(融合表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH1的ORF5基因和猪圆环病毒2型(PCV-2)修饰型ORF2(ORF2m))表达盒构建重组病毒rPRV-PRRSV-3。Western blot表明,外源目的基因均能正确的表达。小鼠动物实验证实,rPRV-PRRSV-2、 rPRV-PRRSV-3均能诱发免疫动物产生与亲本株rPRV-GP5m-M相当的特异性抗PRV抗体,并观察到诱发不同程度的特异性抗PRRSV的免疫应答,其中rPRV-PRRSV-3能够诱发更高的中和抗体水平和细胞免疫水平。5、杆状病毒表达系统介导的PRRSV基因工程疫苗研究由于杆状病毒不能在哺乳动物细胞内复制,对哺乳动物来说非常安全,所以可以用来作为将外源基因投送到体内的载体。本研究利用VSV-G修饰过的杆状病毒作为载体,消除了杆状病毒的补体敏感性。在转移载体pFast-VSV-G下游插入分别由CMV启动子驱动的编码PRRSV ORF3 (截去疏水区2-64aa)、ORF4、ORF5(修饰后)、ORF6基因,构建重组质粒pFast-CMV-ORF3456。然后将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体Bacmid-CMV-ORF3456,提取Bacmid的基因组并经脂质体介导转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-CMV-3456。将BV-G-3456分别以109pfu,108pfu,107pfu的剂量肌肉注射免疫小鼠,结果表明构建的重组杆状病毒BV-CMV-3456比BV-CMV-EGFP能诱导更强的免疫反应,并呈明显的剂量依赖性。