研究背景和目的：对于缺血性心脏病病人,需要尽早开通闭塞的冠状动脉,有效恢复缺血心肌的血液灌注。然而大量研究证实,再灌注治疗可以导致心肌明显损伤,这种损伤被称为“缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, I/R) "。临床心脏治疗策略的发展,需要减少这种缺血再灌注损伤。缺血预适应是指在缺血指征之前进行干预而发挥心脏保护作用,但对于缺血事件不可预知的病人,该措施则不可应用。因此,在心肌再灌注时进行的干预——后适应(postconditioning)则为治疗提供更大的可能性。后适应是指在心肌缺血后、长时间再灌注之前,进行一次或数次短暂重复的心肌I/R,能提高心肌对之前发生的较长时间缺血的耐受性。该措施从2002年提出至今,已有许多独立的不同物种动物实验及临床试验证明了其有效性。且与预适应相比,它具有更好的可预测性和临床可控性。但后适应也可能会导致潜在的并发症。因而有学者提出“药物后适应”,即通过使用模拟内源性机制的药物来发挥后适应的保护作用。而应用药物后适应则需要对后适应的机制进行研究。目前参与缺血后适应介导心脏保护的机制尚未完全弄清。人们对缺血后适应所介导的心脏保护作用提出了许多机制,如减少活性氧的产生、开放线粒体膜ATP敏感性钾通道、抑制线粒体钙超载、减弱炎症反应,改善内皮功能等。有研究发现cAMP浓度改变参与了预适应对缺血心脏的保护作用。而影响活化腺苷酸环化酶(adenyl cyclase, AC)/cAMP通路的药物能引出缺血心肌的延迟保护作用。但cAMP在后适应中的作用还不是很清楚。另一方面,NO (nitrogen monoxidum)是调节心功能的重要介质之一,其在心肌缺血中的作用受到高度重视。NO对心脏的作用表现出双向性：低浓度时可舒张冠脉、增加心肌收缩性,而高浓度则产生负性肌力作用。而NO在后适应中的作用及相关的信号转导途径也不清楚。基于以上认识,我们采用离体心脏灌流和原代培养心肌细胞两个模型,观察后适应对心脏组织的保护作用,以及AC抑制剂SQ22536,PDE4(phosphodiesterase 4, PDE4)抑制剂咯利普兰,一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制剂L-NAME、和左旋精氨酸(L-arginine)对后适应的影响,探讨后适应是否通过cAMP-cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein, CREB)和NO-NOS信号转导途径影响炎性因子及主要凋亡调节因子而发挥心脏保护作用。材料与方法：一、离体心脏实验部分59只SD大鼠,体重210-260 g,随机分为7组(每组7-11只)：Con组,I/R组,后适应组,后适应+咯利普兰(1,5,10μM)组,缺血再灌+咯利普兰组。建立大鼠心脏Langendorff灌注模型。在平衡期、复灌2 min、10 min、20 min、30 min、60 min记录左室发展压(left ventricular developed pressure, Lvdp)冠脉流量(coronary flow, CF),测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine phosphokinase, CK)含量。检查复灌60 min后心肌组织中NO含量、TNOS/iNOS、CK活性、iNOS蛋白表达(western blotting), iNOS、CREB、TNF-α、IL-1β、caspase-3、bcl-2/bax基因表达(realtime-PCR),并行组织病理学检查(HE染色)。二、原代培养乳鼠心肌细胞实验部分原代培养乳鼠心肌细胞,通过细胞活力检测(MTT法)确定氧糖剥夺最适时间,制备细胞低氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)及后适应处理模型。然后分别以PDE4抑制剂咯利普兰、AC抑制剂SQ22536、非选择性NOS抑制剂L-NAME及NO供体L-arginine进行处理,以观察后适应或／和药理性工具药对心肌细胞的影响：检测细胞培养液中CK和LDH活性、NO释放,并通过Realtime-PCR检测CREB、TNF-α、IL-1β、caspase-3、bcl-2/bax基因表达情况。结果：一、离体心脏实验部分I/R能显著降低离体灌流心脏的Lvdp恢复率和CF(分别由79.61%减至37.71%、7.40 ml减至4.24 ml,均P=0.000)、增加冠脉流出液中LDH和CK释放(分别由352.12 U/L和1.90 U/ml增至615.71 U/L和2.61 U/ml,均P=0.000),心肌组织内CK活力增高(10.42 U/g port增至13.29U/g port,P=0.043),组织病理学检查也显示明显的组织损伤。而后适应能改善心功能,表现为Lvdp恢复率增加和CF增加(分别为51.35%和5.24 ml,P=0.008和0.001),冠脉流出液中LDH和CK释放减少(473.19 U/L和2.10 U/ml,P= 0.000和0.001),心肌组织内CK活力降低(11.90 U/g port, P= 0.022),组织病理学损伤改变有所减轻。PDE4抑制剂咯利普兰(10μmol/L)能显著增强后适应对心脏的保护作用,表现为Lvdp恢复率增加至64.11%(P=0.022),CF增加至6.53 ml(P=0.002),冠脉流出液中LDH和CK释放减少至399.07 U/L和1.89U/ml(P= 0.000和0.025),心肌组织内CK活力也降至10.65 U/g port(P=0.024),而单用该抑制剂则不能表现出保护作用。咯利普兰(10μmol/L)能显著降低心肌组织内NO含量(P=0.000)和TNOS/iNOS(P=0.015和0.001)、CK活性(P=0.034)、iNOS蛋白和基因表达(P=0.004)；增加CREB基因表达(P=0.000),降低炎症因子TNF-α和IL-1β基因表达(均P=0.001)、凋亡调节基因caspase-3表达降低(P=0.001)、bcl-2/bax比值增高(P=0.005)。咯利普兰未与后适应同时干预时则对上述指标无显著影响。二、原代培养乳鼠心肌细胞实验部分与Con组相比,H/R组心肌细胞活力显著降低(相对值为0.32,P=0.000)。H/R显著增加培养液中LDH和CK释放(分别由259.26 U/L、1.01 U/ml增至690.61 U/L、3.55 U/ml,均P=0.000)。而后适应能显著增强心肌细胞活力(相对值为0.42,P=0.000),培养液中LDH和CK释放显著减少(分别为480.84 U/L和2.36 U/ml,P=0.003和0.000)。PDE4抑制剂咯利普兰(10μmol/L)和NO供体L-arginine能显著增强后适应对心肌细胞的保护作用,而AC抑制剂SQ22536则显著减弱后适应对心肌细胞的保护作用。非选择性NOS抑制剂L-NAME则在较低浓度(20和100μmol/L)表现出对H/R细胞的保护作用,而在高浓度(1000μmol/L)时不表现出来。咯利普兰(10μmol/L)能显著降低细胞培养液中NO含量(由163.39μmol/L降至114.45μmol/L, P=0.000);显著增加CREB基因表达(相对值由0.59增至0.73,P=0.025)；显著降低iNOS和TNF-α, IL-1β基因表达(相对值分别由1.90、5.06和5.02减至1.36、3.85和3.83,P=0.000、0.001和0.000)；凋亡调节基因caspase-3表达显著降低(相对值由2.37减至1.94,P=0.000)、bcl-2/bax比值也显著增高(由0.11增至0.21,P=0.000)。而SQ22536表现出与咯利普兰相反的作用。咯利普兰或SQ22536未与后适应同时干预时则对上述指标无显著影响。L-arginine则对CREB、TNF-α、iNOS、IL-1β和caspase-3、bcl-2、bax基因表达均无显著影响。而20μmol/L的L-NAME则显著降低iNOS和TNF-α、IL-1β基因表达(由2.60、7.87和8.66减至1.78、5.92和6.40,P=0.000、0.021和0.000)；凋亡调节基因caspase-3表达显著降低(相对值由3.43减至2.28,P=0.000)、bcl-2/bax比值也显著增高(由0.04增至0.08,P=0.001)。1000μmol/L的L-NAME对TNF-α、IL-1β、caspase-3、bcl-2和bax基因表达无显著影响。该两影响NO的工具药均不影响CREB基因表达。结论：缺血后适应对心肌细胞具有保护作用,该作用可能是通过cAMP-CREB信号组分对NO-iNOS进行调节,继而下调急性炎症因子TNF-α、IL-1β和凋亡调节基因caspase-3、bax来发挥的。