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人肠道病毒68型(EV-D68)是肠道病毒D组成员,被发现与多种疾病有关,主要引起呼吸系统疾病及神经系统并发症。近十年来,在全球多个国家和地区频繁报道EV-D68的爆发流行。目前对感染EV-D68患者的主要治疗手段为支持性治疗,没有针对病毒的特效治疗药物,也没有疫苗预防EV-D68的爆发。肠道病毒与细胞凋亡密切相关,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)是细胞凋亡发生的重要蛋白,其中Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。那么EV-D68是否通过Caspase通路诱导细胞凋亡,其机制怎样?与宿主细胞的相互作用关系怎样?Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FMK)是否还能起到抑制病毒增殖的作用?本研究即致力于说明这些问题。实验方法:首先,探讨EV-D68导致的细胞病变效应是否为凋亡,以RD细胞作为观察对象,通过细胞形态学、Hoechst核染色、PI染色、DNA ladder、Western Blot等分析发生病变效应时的细胞状态、DNA降解的特征以及细胞内病毒蛋白vp1和活性Caspase-3蛋白表达情况。然后,分析Caspase-3抑制剂对感染EV-D68的宿主细胞的保护作用以及对EV-D68的产生的影响,通过细胞形态学、细胞计数、流式细胞术、Western Blot及活性测定等实验分析感染24 h后细胞形态、细胞数量、细胞周期、细胞内的活性Caspase-3的蛋白表达及活力值的变化;RT-qPCR分析感染EV-D68后2 h、12 h、24 h细胞内病毒基因组水平,Western Blot以及TCID50分析感染后24 h的细胞内病毒蛋白vp1表达以及上清和细胞中总的病毒粒子数量的变化。同时,分析Caspase-3激活剂(PAC-1)对EV-D68产生的影响,RT-qPCR分析激活剂处理12 h后细胞内病毒基因组的表达情况,Western Blot以及TCID50分析激活剂处理24 h后细胞内病毒蛋白表达以及上清和细胞中总的病毒粒子数量的变化。紧接着,我们对EV-D68是否激活Caspase-3的上游Caspase-8和Caspase-9进行探究,通过活性测定和Western Blot观察感染24 h后的细胞内Caspase-8和Caspase-9的活力值变化以及Caspase-3、8、9的活性形式表达情况。最后,我们检测了EV-D68对EV71常见靶细胞RD、293T、Vero、MRC5四种细胞系的感染情况,通过RT-qPCR和细胞计数分析EV-D68在细胞内的基因组水平以及细胞数量的变化。结果与分析:1.EV-D68感染RD细胞诱导细胞凋亡:感染EV-D68的RD细胞出现皱缩、变圆、脱离培养皿等明显的细胞病变效应,且与对照组相比,EV-D68感染组的Hoechst细胞核染色荧光增强,DNA梯度化,但PI染色阴性,可以确认EV-D68诱导的细胞病变作用是凋亡。2.Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FMK)缓解EV-D68引起的细胞病变、G0/G1期阻滞以及Caspase-3的激活:细胞形态学观察显示,EV+In组较EV+Con组可明显缓解皱缩、变圆、脱离培养皿的现象;细胞计数结果显示,与Mock+Con组(125.00±12.49)×10~4相比,EV+Con组的细胞数(56.33±11.84)×10~4明显减少,而EV+In组细胞数(98.00±8.50)×10~4(P<0.01)明显恢复;流式细胞术结果显示,与Mock+Con相比,EV+Con增加了G0/G1期的细胞百分比(P<0.001),Caspase-3抑制剂处理(EV+In)后,G0/G1期细胞阻滞现象明显缓解(P<0.01);Western Blot及活性测定结果显示,EV+Con组的活性Caspase-3蛋白的表达及活力值均高于Mock+Con,而EV+In组的Caspase-3蛋白的表达及活力值被明显抑制。3.Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FMK)不影响EV-D68进入宿主及细胞内基因组复制,但可以减少成熟期病毒蛋白表达,进而减少EV-D68病毒粒子的产生:RT-qPCR结果显示,感染EV-D68后2 h、12 h,Con组和Cas3 In组细胞内病毒基因组水平并无差异,而感染后24小时Con组的病毒基因组水平、vp1蛋白表达、上清和细胞中总的病毒粒子数均明显高于Cas3 In组。4.Caspase-3激活剂(PAC-1)不影响EV-D68的复制,但可以增加成熟期病毒蛋白的表达,增加EV-D68病毒粒子的产生:RT-qPCR结果显示,PAC-1不影响感染后12 h细胞内病毒基因组的复制水平。Western Blot结果显示,感染后24 h,随着PAC-1剂量的增加(0μM、0.2μM、0.5μM)细胞内病毒蛋白表达也增加。TCID50结果显示,感染后24 h,PAC-1处理组的病毒粒子数(25.57±3.86×108)较Mock组(2.06±0.98×108)明显增加(P<0.001)。5.RD细胞中激活的Caspase-3被EV-D68用于自身的扩增:综合3-4的结果,得出此结论。6.EV-D68激活Caspase-3是通过激活上游Caspase-8和Caspase-9而实现的:Caspase活性测定及Western Blot结果显示,EV-D68感染组(EV+Con)的Caspase-8和Caspase-9活性形式的蛋白表达明显增多,活性也增加,而抑制剂处理组(EV+In8/9)则会抑制它们的激活,同时Caspase-3的激活也被抑制。7.EV-D68在RD及293T细胞系中可引起细胞病变效应,而在Vero和MRC5细胞系中无影响:RT-qPCR及细胞计数结果显示,在293T和RD细胞系中,MOI为2的EV-D68感染组(EV-D68)较对照(Con)基因组复制增加,且细胞数量减少。而MOI为5的EV-D68在同等细胞数的MRC5和Vero细胞系中病毒基因组Ct值大于30(视为未检测到目标基因)且EV-D68感染组(EV-D68)与对照(Con)细胞数量无差别。结论:Caspase-3在EV-D68的致病和产生过程中都起重要作用,可以作为治疗和预防EV-D68的靶点,其抑制剂有抑制EV-D68的作用。创新点:1.首次发现EV-D68是通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡进而导致细胞病变作用。2.首次发现Caspase-3在EV-D68的产生过程中发挥重要作用。3.首次发现Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FMK)对EV-D68感染的宿主细胞具有保护作用。