艾滋病(AIDS)是获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的简称,由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染引起,以进行性破坏人体免疫功能,最终导致机会性感染和恶性肿瘤发生为特征的慢性传染病,严重威胁着全人类健康。HIV主要攻击人体免疫细胞,破坏CD4~+T细胞功能,表现为T淋巴细胞功能亚群(CD4~+CD28~+、CD8~+CD28~+)、纯真细胞(CD4~+CD45RA+CD62L+)、记忆细胞(CD4~+CD45RO+)显著减少,免疫活化标记CD38、HLA-DR表达异常升高。HIV感染本身及上述异常的免疫状态均能破坏T淋巴细胞的功能,不利于病毒清除。HIV-1特异性细胞毒性T淋巴细胞(HIV-1 specific cytotoxic T lymphocyte, CTL)应答在控制病毒复制,延缓疾病进展中发挥重要作用。研究表明,长期无进展者(Long term nonprogressors, LNTP)体内存在强大而广泛的特异性CTL应答和低水平的病毒复制;疾病进展期患者体内HIV-1特异性CTL应答明显降低,最终无法清除病毒。HIV-1特异性CTL功能受损的机制尚不明确,可能与辅助性T细胞(Helper T cells,Th)功能丧失或减弱、特异性抗原减少及CD4~+CD25+Tregs (Regulatory T cells, Treg cells)的免疫调节和抑制作用有关。CD4~+CD25+Tregs既能抑制免疫活化,避免细胞过度损伤;又能抑制CD4~+T细胞、CD8~+T细胞功能,抑制细胞免疫应答,不利于病原体清除。人CD4~+T细胞上CD25荧光强度分为弱、中、强三个等级,目前认为仅CD4~+CD25hiTregs能特异性代表人CD4~+CD25+Tregs,然而CD25在活化、记忆CD4~+T细胞也高表达,不能单独作为定义Tregs的特异性标记。研究证实,CD127(IL-7 receptorαchain)在CD4~+T细胞表面低表达,与FoxP3表达负相关,并具有和CD4~+CD25+FoxP3+T细胞相似的功能,故CD127和CD25可作为定义Tregs的表面标记。高效抗反转录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy, HAART)是最有效控制和治疗AIDS的方法,能降低病毒载量,提升CD4~+T细胞数量、CD28表达比例及纯真细胞、记忆细胞数量,减轻免疫活化程度,但均无法恢复至正常水平。目前HAART治疗与HIV-1特异性CTL应答的关系有以下3种观点:1. HAART治疗后病毒载量低于检测下限开始HIV-1特异性CTL应答迅速减弱并消失。2. HAART治疗后病毒载量持续低于检测下限者仍能检测到HIV-1特异性CTL应答。3.低水平的病毒复制可能更有助于刺激HIV-1特异性CTL应答。研究报道HAART治疗对CD4~+CD25+Tregs频率和功能的影响不一致,原因可能是对CD4~+CD25+Tregs定义不同、研究对象的入组标准不同。我国2004年开始对AIDS患者实施“四免一关怀”政策,使越来越多的患者能接受以国产免费抗病毒药物为主的HAART方案治疗。目前对使用国产免费抗病毒药物为主的HAART方案治疗AIDS患者病毒学和免疫学应答的前瞻性研究较少,尤其缺少国产免费抗病毒药物治疗为主的方案治疗后HIV-1特异性CTL应答、CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg变化的前瞻性研究。研究目的初步探讨以国产免费抗病毒药物为主的HAART方案治疗AIDS患者病毒学和免疫学应答情况。研究对象与研究方法1.研究对象(1)入选的40例AIDS患者均在广州市第八人民医院艾滋病专科就诊并定期随访,男24例,女16例,平均年龄37岁,范围20~63岁。健康对照组22例为志愿者,男8例,女14例,平均年龄26岁,范围18~37岁。(2)病例均经广东省或广州市疾病预防与控制中心蛋白印迹试验(WesternBlot)确认。(3)治疗前CD4~+T细胞计数平均为201cells/uL(10~340cells/uL)。(4)治疗方案为司他夫定(D4T)+拉米夫定(3TC)+奈韦拉平(NVP)者21例,齐多夫定(AZT)+拉米夫定(3TC)+奈韦拉平(NVP)19例。D4T、NVP、AZT分别购自上海迪赛诺生物医药有限公司、厦门迈克制药有限公司、东北制药厂;3TC购自葛兰素史克有限公司。(5)入选患者接受规范的HAART方案治疗,于治疗4周、12周、24周、36周、48周随访。2.研究方法(1)标本采集治疗前及各随访时间点采集血标本,分离血浆及PBMC(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)保存待检。(2)病毒载量检测采用RT-PCR方法,Roche公司的COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan 48自动载量仪测定血浆病毒载量,最低检测范围是40copies/mL。(3)CD4~+T细胞、CD8~+T细胞绝对计数检测应用BD公司绝对计数(TruCOUNT)管,FACSCalibur流式细胞仪MULTISET软件检测新鲜全血中CD4~+T细胞、CD8~+T细胞绝对计数。(4)CD4~+CD28~+、CD8~+CD28~+检测三色流式细胞术检测AIDS患者及健康对照组PBMC中CD4~+CD28~+、CD8~+CD28~+比例。(5)CD4~+CD45RA+、CD4~+CD45RO+绝对计数检测先测定外周血白细胞计数和淋巴细胞分类百分率,计算淋巴细胞绝对计数。三色流式细胞术检测AIDS患者PBMC中CD4~+CD45RA+、CD4~+CD45RO+百分比,将淋巴细胞绝对计数与上述双阳性细胞占淋巴细胞的百分率相乘,即为绝对计数值。(6)CD8~+CD38~+、CD8~+HLA-DR+检测三色流式细胞术检测AIDS患者及健康对照组PBMC中CD8~+CD38~+、CD8~+HLA-DR+比例。(7)HIV-1特异性CTL应答频率和强度检测采用美国BD公司人γ-干扰素(Interferon-γ, IFN-γ)试剂盒,酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot, ELISPOT)技术,以HIV-1 P24区域的氨基酸序列人工合成的12个重叠肽段组成的肽段库作为特异性抗原表位刺激外周血单个核细胞,检测IFN-γ分泌细胞频率,分析HIV-1特异性CTL应答水平。(8)CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg比例与绝对计数值检测先测定外周血白细胞计数和淋巴细胞分类百分率,计算淋巴细胞计数。三色流式细胞术检测AIDS患者及健康人PBMC中CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg比例;将外周血淋巴细胞绝对计数与CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg占CD4~+T细胞百分率相乘即绝对计数值。结果1.病毒学应答40例患者治疗前病毒载量为4.54 log10copies/mL (2.36~5.98 log10 copies/mL)。4周、12周、24周、36周、48周分别下降为2.28 log10 copies/mL (1.70~3.07 log10 copies/mL)、1.87 log10 copies/mL (0.00~2.61 log10 copies/mL)、1.60 log10 copies/mL (0.00~3.56 log10 copies/mL)、0.00 log10 copies/mL (0.00~3.10 log10 copies/mL)、0.00 log10 copies/mL (0.00~4.80 log10 copies/mL)。4周、12周、24周、36周、48周病毒载量<40copies/mL的百分比分别为0%、30%、70%、80%、92.5%。各时间点病毒载量均显著低于治疗前(P值均<0.05)。2.免疫学应答2.1 CD4~+T细胞计数40例患者治疗前CD4~+T细胞计数为201.80±91.84 cells/uL。4周、12周、24周、36周、48周分别上升为306.75±146.41、356.23±149.09、379.35±169.20、401.30±190.11、348.23±149.75 cells/uL,前4周上升速度最快。各时间点CD4~+T细胞计数显著高于治疗前(P值均<0.05)。2.2 CD4~+CD28~+、CD8~+CD28~+22例患者治疗前CD4~+CD28~+为78.94±13.80%,明显低于健康对照组98.36±1.62%(P=0.000)。24周、36周、48周分别上升为88.78±7.25%、91.35±6.08%、92.90±3.39%,各时间点CD4~+CD28~+均显著高于治疗前(P=0.000)。治疗前CD8~+CD28~+为16.19±7.01% ,明显低于健康对照组50.17±18.31%(P=0.000)。24周、36周、48周分别上升为20.63±8.55%、20.28±9.13%、18.42±11.98%,各时间点CD8~+CD28~+均高于治疗前,但无统计学意义(P均>0.05)。2.3 CD4~+CD45RA+、CD4~+CD45RO+25例患者治疗前CD4~+CD45RA+绝对计数为42±29 cells/uL。4周、12周、24周、36周、48周分别为37±24、59±32、64±40、72±47、74±36 cells/uL。4周下降,与治疗前相比无显著性差异(P=0.452)。12周开始上升,12周、24周、36周、48周CD4~+CD45RA+绝对计数均显著高于治疗前(P <0.05)。治疗前CD4~+CD45RO+绝对计数为55±24 cells/uL。4周、12周、24周、36周、48周分别上升为69±30、92±33、107±43、129±42、143±48 cells/uL。各时间点CD4~+CD45RO+绝对计数均显著高于治疗前(P均<0.005)。2.4 CD8~+CD38~+、CD8~+HLA-DR+14例患者治疗前CD8~+CD38~+为42.70±17.10%,明显高于健康对照组22.21±6.80%(P=0.001)。4周、12周、24周、36周、48周分别下降为38.2±22.78%、34.78±17.04%、28.02±11.72%、18.29±7.72%、21.59±11.77%。4周与治疗前相比无显著性差异(P=0.512),余时间点CD8~+CD38~+均显著低于治疗前(P <0.05),36周、48周已接近健康对照组。治疗前CD8~+HLA-DR+为40.49±13.15% ,明显高于健康对照组6.59±2.85%(P=0.000)。4周、12周、24周、36周、48周分别为47.33±31.06%、27.70±19.76%、24.45±12.46%、17.81±7.07%、14.30±10.27%。4周上升,与治疗前相比无显著性差异(P>0.05),12周起下降,24、36、48周CD8~+HLA-DR+与治疗前相比有显著性差异(P<0.05),但48周仍高于健康对照组(P=0.000)。2.5 HIV-1特异性CTL应答率和应答强度2.5.1 HIV-1特异性CTL应答与HAART治疗的关系40例患者治疗前HIV-1特异性CTL应答率为15%。4周、12周、24周、36周、48周特异性CTL应答率分别为17.5%、35%、50%、50%、40%,12周开始应答率迅速增加并维持在一个较高水平,12周、24周、36周、48周CTL应答率显著高于治疗前(P<0.05)。治疗前HIV-1特异性CTL应答强度为0SFC/106PBMC(0~987 SFC/106PBMC)。4周、12周、24周、36周、48周分别为0 SFC/106PBMC (0~2796 SFC/106PBMC)、26 SFC/106PBMC (0~1780SFC/106PBMC)、53.5 SFC/106PBMC (0~2110 SFC/106PBMC)、46.5 SFC/106PBMC (0~1830 SFC/106PBMC)、11.5 SFC/106PBMC(0~1295 SFC/106PBMC)。12周开始应答强度迅速增加并维持在一个较高水平。4周应答强度与治疗前无差异(P=0.694),12周、24周、36周、48周CTL应答强度均显著高于治疗前(P均<0.05)。2.5.2 HIV-1特异性CTL应答与病毒载量的关系40例患者各随访时间点依病毒载量分为两组:<40copies/mL组(n=109)、>40copies/mL组(n=91)。两组HIV-1特异性CTL应答率分别为(45.87%, n=109)、(29.67%, n=91),病毒载量<40copies/mL组CTL应答率明显高于病毒载量>40copies/mL组(χ2=5.498, P=0.019)。两组HIV-1特异性CTL应答强度分别为[40 SFC/106PBMC (0~1830 SFC/106PBMC), n=109]、[20 SFC/106PBMC (0~2796 SFC/106PBMC), n=91],病毒载量<40copies/mL组CTL应答强度明显高于病毒载量>40copies/mL组(Z= -2.500, P=0.012)。2.5.3 HIV-1特异性CTL应答与CD4~+T细胞计数的关系40例患者各随访时间点依CD4~+T细胞计数分为两组:≤350cells/uL组(n=96)、>350cells/uL组(n=104)。两组HIV-1特异性CTL应答率分别为(34.38%, n=96)、(42.31%, n=104)。CD4~+T细胞计数>350cells/uL组应答率高于CD4~+T细胞计数≤350cells/uL组,但无显著性差异(χ2=1.327, P=0.249)。两组HIV-1特异性CTL应答强度分别为[25 SFC/106PBMC (0~1295 SFC/106PBMC), n=96]、[29(0~2796 SFC/106PBMC), n=104],CD4~+T细胞计数>350cells/uL组应答强度高于CD4~+T细胞计数≤350cells/uL组,但无显著性差异(Z= -0.786, P=0.432)。2.6 CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率2.6.1 AIDS患者CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率及其与CD4~+T细胞计数的关系患者治疗前CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率为4.55±2.83%,明显高于健康对照组3.29±1.47%(P<0.05)。治疗前将CD4~+T细胞计数分为≤200cells/uL组(n=15)、CD4~+T细胞计数>200cells/uL(n=25)组。CD4~+T细胞计数≤200cells/uL组CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率显著高于CD4~+T细胞计数>200cells/uL组(P=0.008)。无论HAART治疗与否,把CD4~+T细胞计数分为≤200cells/uL组(n=54)、>200cells/uL组(n=186) , CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg分别为5.04±2.61%、3.86±2.07%。CD4~+T细胞计数≤200cells/uL组CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率明显高于CD4~+T细胞计数>200cells/uL组(P=0.007)。2.6.2 CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率和绝对计数与HAART治疗的关系16例患者治疗前、12周、24周、36周、48周CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率分别为4.55±2.83%、3.65±1.65%、4.51±2.10%、4.31±2.48%、3.78±1.96%。HAART治疗对CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率无显著影响(P=0.244)。治疗前、12周、24周、36周、48周CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg绝对计数分别为6.68±4.48、6.51±3.49、7.32±3.31、8.41±3.62、6.95±4.22 cells/uL。24周起升高,各时间点与治疗前相比无显著性差异(P>0.05)。2.6.3 CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率与HIV-1特异性CTL应答强度、CD8~+CD38~+、CD8~+HLA-DR+的相关性根据各时间点CTL应答检测结果,分为HIV-1特异性CTL应答组(n=54)与无应答者组(n=46),CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率分别为(3.98±1.72%, n=54)、(4.28±2.12%, n=46)。CTL应答组CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率低于无应答组,但无显著性差异(F=0.606, P=0.438)。Spearman相关分析发现特异性CTL应答强度与CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率负相关(n=100, r=-0.267, P=0.05)。Spearman相关分析发现CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率与CD8~+CD38~+、CD8~+HLA-DR+无显著性相关(P均>0.05)。研究结论1.国产免费抗病毒药物为主的HAART方案治疗能有效抑制病毒复制,提升CD4~+T细胞、纯真细胞和记忆细胞数量,降低免疫活化,部分实现免疫重建。2.国产免费抗病毒药物为主的HAART方案治疗能提升HIV-1特异性CTL应答。3. CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率与疾病进展有关。HAART治疗对CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率及绝对计数无明显影响。4. CD4~+CD25hiCD127lo/-Treg频率与HIV-1特异性CTL应答强度负相关、与免疫活化程度无显著性相关。