软骨畸形和缺损的修复是目前整形外科及关节外科最大的难题之一,组织工程技术的诞生为解决这一问题带来了希望。软骨组织结构单一,仅由细胞和细胞外基质构成,不含神经、血管等组织。因此,早在1994年就有了组织工程软骨的研究,内容涉及种子细胞、支架材料、生长因子、构建方法等。至今为止,利用组织工程技术已经可以在动物体内和体外构建出软骨组织,并可具有一定的形态和体积。应用组织工程技术修复关节软骨也在临床上得到应用,并且取得了一定的效果。然而,在不断探索的过程中学者们也发现了一些影响着组织工程软骨技术发展的问题和障碍。例如:种子细胞来源问题、支架材料与细胞、机体之间不可控制的相互干扰,如何保持组织工程软骨的生物学特性长期稳定等。因此,组织工程技术构建的软骨组织目前仍无法实现真正意义上的临床应用,人们在认识到问题的同时仍然在不断地寻求解决问题的方法。目的:本课题设计以临床应用为出发点,研究如何在体外构建具备一定形态、体积和机械强度的组织工程软骨移植体,并用于软骨缺损的修复。其目的在于:①探索具有更高的细胞利用效率和获取更多数目种子细胞的细胞分离培养方法。②在细胞膜片技术的基础上,研究如何在无支架材料的状态下构建具备三维立体结构的软骨组织并消除干扰。③突破了传统的软骨组织工程方法,尝试一种全新的仿生细胞聚集培养复合外部支撑体的构建方法。④研究如何利用生物反应器在体外重建出具备透明软骨特性的组织工程软骨。⑤观察将体外构建的软骨移植体植入动物体内后继续分化成熟的能力和分化稳定性的保持。⑥初步探索用组织工程软骨修复软骨缺损。方法和结果:实验中,首先利用原代细胞和传代细胞聚集共培养以及高密度连续复层培养的模式有效地分离培养兔自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞,并获得了足够的细胞数量。模拟胚胎软骨组织形成特点,成功地在体外构建出由细胞及其自身分泌细胞外基质构成的仿生细胞膜片,并对其理化特性进行了研究。在此基础上,利用自体软骨细胞膜片在体外生物反应器中构建软骨组织。结果发现,作为分化成熟组织,软骨细胞虽然能直接分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖,但是其增殖能力有限,在体外条件下难以构建出组织结构均匀、具备良好机械强度的移植体,但进入动物体内仍然能分化为成熟软骨组织。由于软骨细胞来源有限,扩增传代难以保持表型的稳定,所以,获得大量的软骨细胞是很困难的。因此,在接下来的实验中,尝试用骨髓间充质干细胞作为种子细胞。首先在体外用离心沉淀法和高密度连续培养诱导方法成功构建出了小球状和片状软骨组织,并且进一步证实了细胞接种密度和动态应力培养环境对软骨形成和成熟的重要性。在体外用骨髓间充质干细胞的诱导形成软骨组织后,采用PLGA作为细胞聚集体之外的支撑体进行人鼻翼形态和气管形态的软骨构建。用简单的包裹技术将细胞膜片与支撑体复合进行体外动态诱导培养,成功地在体外形成了质地均匀、机械强度良好、类似透明软骨的组织工程移植体,并进行体内移植试验获得成功。最后利用该技术我们尝试修复兔耳廓软骨直径1cm的全层缺损,在12周以后发现缺损区新生软骨形成并完成了缺损的修复,同时进行对比研究并分析其原理和机制。结论:研究结果表明,细胞聚集培养模式+外支架与支撑体的构建策略在优化的生物反应器条件下能够诱导形成具备特定形态仿生的组织工程软骨。高密度的聚集培养方式有利于软骨细胞保持原有的表型,并且能使去分化的软骨细胞恢复表型。细胞膜片是由细胞和其自身分泌的基质组成,无论从组织发生还是内部结构等方面来讲,都非常类似于天然软骨的形成过程,是一种具有极高的细胞利用率的全新的细胞接种方式,从而使我们能够将支架材料对组织形成的干扰尽量减小或者在完全无支架材料的状态下形成软骨组织。为了获得特定的组织形态,支撑体策略也是本研究的创新点之一,同时也为体外构建具备特定形态的软骨组织提供了一个简单实用的方法,实验结果证明外部支撑技术在维持形态的同时,更重要的作用是充分利用细胞膜片的理化特性,提高了可操作性,是一种全新的构建具备特殊形态软骨组织的有效手段。在对耳廓软骨组织缺损的修复进行初步尝试后,我们相信通过不断的探索和完善,有可能将该技术最终应用于临床实际工作中。