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目的研究肺炎支原体(MP)特异性蛋白免疫反应性以及用该蛋白检测合肥地区138份儿童血清样本中相应Ig G抗体的的情况,检测血清样本中细胞因子水平并分析63份肺泡灌洗液MP阳性标本的P1基因型和引起该疾病的危险因素。方法r P1-513蛋白ELISA方法:首先培养FH-MP标准菌株,从其培养液中提取基因组DNA,设计特异性引物采用普通PCR技术扩增获得基因r P1-513目的基因。将目的基因先连接到T载体上再连接到PQE-80L表达载体上,利用诱导剂诱导PQE-80L-r P1-513重组菌蛋白表达。12%SDS-PAGE电泳初步确定蛋白表达情况,并扩大培养,纯化r P1-513蛋白。蛋白免疫印迹法来验证纯化r P1-513蛋白免疫反应性。利用r P1-513蛋白作为包被蛋白构建的ELISA方法。儿童血清MP抗体的检测:采用r P1-513蛋白ELISA方法和商业ELISA试剂盒检测儿童血清样本中感染MP的情况,并比较两者的灵敏度和特异性进行分析。细胞因子的测定:血清标本分为感染和未感染MP两组,而感染MP的血清标本进一步分成重症组,轻症组(重症组11人、轻症组13人)。对照组有20名正常儿童,这些儿童与实验组年龄和性别的大致相同。初步检测一下两个实验组血清中白介素8、10和18表达水平的情况,以及感染MP的危险因素。MP肺泡灌洗液标本P1基因分型:收集到的63例儿童的肺泡灌洗液标本提取基因组DNA,筛选出阳性标本,针对阳性标本以基因组DNA为模板通过巢式PCR和多重PCR技术对其基因型进行分析。同时设对照实验组(MP-FH标准菌株)。巢式PCR和多重PCR的扩增的最终基因片段通过DNA片段胶回收试剂盒切胶回收纯化后连接到T载体中制备重组质粒,对重组质粒进行基因测序鉴定。结果①构建了含r P1-513基因的重组质粒,并诱导其表达纯化,经Western blot法检测与感染MP的血清中相应的抗体有免疫反应性,而与未感染MP的血清无反应性。r P1-513蛋白ELISA和商业ELISA试剂盒检测MP抗体的敏感度分别为97.14%和91.42%,两者特异性都为100%。②经SPSS 16.0统计学分析与MP感染的因素有C-反应蛋白,而性别,年龄,白细胞都与其无关。③患有MPP的儿童血清中IL-8、L-10和IL-18水平比正常儿童血清中的IL-8,IL-10和IL-18水平高(P<0.01)。④IL-10在患有严重MPP的患儿血清中的水平比轻症组血清中的表达水平低(P<0.01)。⑤但是IL-18在重症组血清中的水平比轻症组血清中的水平高(P<0.01)。⑥同时实验数据分析也显示IL-8和IL-18都与C-反应蛋白有相关性(r=0.451,P<0.05;r=0.594,P<0.05)。⑦巢式PCR和多重PCR技术扩增检测显示,63例肺泡灌洗液标本中筛查出了15例MP阳性标本,且15例MP阳性标本基因型都为P1-I型,对照组基因型为P1-II型。重组质粒经过测序后进行片段比较验证其扩增条带均正确。结论初步证明r P1-513蛋白具有免疫反应性,且其作为抗原的ELISA法灵敏度和特异性都比较高,同时分析MP感染与C-反应蛋白有关,为临床在血清学上诊断MP都提供了一定的帮助。从实验数据结果分析可初步得出IL-8、L-10和IL-18在儿童感染MPP后表达水平都呈现上升的趋势。IL-10在重症儿童血清中的表达水平比轻症儿童血清中的表达水平低,这可能是自身免疫反应因素影响的结果。有实验结果可总结出:这些细胞因子在MP感染儿童后影响了机体的免疫调节。初步调查结果显示合肥地区感染MP儿童的基因型为P1-I型。