背景胃癌是恶性肿瘤死亡最主要的原因之一。胃癌术后腹膜转移的发生率在15%-50%甚至更高,成为胃癌死亡最主要的原因。胃癌发生腹膜转移预后很差,平均生存时间在1-1.6月到3.1-9月。对于胃癌腹膜转移的患者,虽然有很多种不同的治疗方法,如腹腔内化疗、腹腔内温热化疗、免疫疗法、高强度聚焦超声等,但是治疗效果却并不理想。因此,阐明胃癌腹膜转移的机制,寻找抑制胃癌腹膜转移的新途径,不仅能更好地改进治疗措施,更能提高患者的生存率。随着1993年第一个micro RNAs(mi RNAs)的发现,人们对其功能的研究也越来越深入。Mi RNAs被证实与多种疾病有关,例如糖尿病、高血压病、艾滋病,及各种肿瘤。大量的研究表明mi RNAs在胃癌的发生、发展、诊断、治疗及预后评估中起到非常重要的作用。在肿瘤中常以抑癌基因或癌基因的身份存在的,起到调节复杂的生物学功能的作用,它能够影响细胞的侵袭、转移增殖、凋亡及分化。Mi RNAs作为一种新的基因,它是通过与靶基因m RNA3’非翻码区(UTRs)完全或部分碱基配对,导致m RNA的降解或抑制m RNA的翻译。虽然目前已经有大量研究表明micro RNA与胃癌之间存在相关性,但是micro RNA在胃癌腹膜转移中的作用及其潜在的作用机制方面的研究较少。在本课题中,我们参考了国内外相关文献报道及前期micro RNA高通量芯片分析的研究,初步检测到micro RNA-214-3p(mi RNA-214、mi R-214)在胃癌腹膜高转移细胞系GC9811-P与胃癌细胞系GC9811中存在着差异性表达,并预测其发挥着特殊的生物学功能。本课题将对mi RNA-214在胃癌腹膜高转移细胞系的表达水平、生物学功能及可能的作用机制进行初步的研究和探讨。目的1.检测mi RNA-214在胃癌细胞系中的表达水平。2.研究mi RNA-214在胃癌细胞系中的生物学功能。3.探讨mi RNA-214在胃癌细胞系中发挥功能的机制。方法1.在相同的条件下复苏并培养细胞GC9811和GC9811-P,待细胞传至2-3代后取对数生长期的细胞提取小RNA,并检测小RNA的OD值在1.8-2.0之间;q RT-PCR的方法验证目的基因mi R-214在细胞GC9811和GC9811-P中的表达差异情况,并用2-ΔΔCt法计算相对值,选U6作为内参对照。2.订购mi RNA-214慢病毒,将空载体病毒和mi RNA-214上调病毒感染人胃癌细胞GC9811,分别标记为GC9811+LV-NC和GC9811+LV-mi R-214;将空载体病毒和mi RNA-214下调病毒感染人胃癌细胞GC9811-P,分别标记为GC9811-P+LV-NC和GC9811-P+LV-mi R-214IH,并使用q RT-PCR的方法验证转染效果。3.运用稳转细胞系进行transwell迁移、侵袭实验,MTT增殖实验、平板克隆实验、细胞凋亡实验等,研究mi R-214异常表达后对胃癌细胞系GC9811/胃癌腹膜高转移细胞系GC9811-P生物学功能的影响。4.用生物信息学分析软件Target Scan、Mi Randa预测mi R-214可能的靶基因,选择与细胞侵袭、迁移能力相关的基因,通过q RT-PCR、Western-blot等方法,对其预测的靶基因编码蛋白进行初步的验证。结果1.胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P中mi R-214表达水平明显升高(10.89±0.25)相对于胃癌细胞GC9811(1.00±0.09),P<0.01;差异具有统计学意义。2.我们成功构建了mi RNA-214稳转细胞系,q RT-PCR鉴定其表达效果,结果显示能显著上、下调mi RNA-214在胃癌细胞内的表达水平。3.上调mi RNA-214后,胃癌细胞GC9811侵袭、迁移和增殖能力明显增强,凋亡能力明显降低;下调mi RNA-214后,胃癌腹膜高转移细胞系GC9811-P的细胞的侵袭、迁移和增殖能力明显减弱,凋亡能力明显增高。4.生物信息学软件分析得出PTEN为mi RNA-214可能的靶基因;q RT-PCR结果显示mi RNA-214不影响PTEN在基因水平的表达;Western-blot初步得出上调mi RNA-214后,PTEN的表达量下降,相反下调mi RNA-214后,PTEN的表达量增高。结论1.Micro RNA-214-3P在胃癌腹膜高转移细胞系中高表达,提示其在胃癌腹膜转移中起着癌基因的作用。2.Micro RNA-214-3P促进胃癌细胞系GC9811和胃癌腹膜高转移细胞系GC9811-P的侵袭、迁移及增殖能力,抑制细胞凋亡。3.PTEN为micro RNA-214-3P的靶基因之一;micro RNA-214-3P不影响PTEN在m RNA水平的表达,而是在转录后水平抑制PTEN的表达。