第一部分施万细胞蛋白质表达谱目的:施万细胞(Schwann cells,SCs)是外周神经系统中的胶质细胞,在外周神经系统再生以及多种外周神经系统疾病中发挥重要的生物学作用。本研究拟通过基于液质联用的高通量蛋白质组学方法建立大鼠施万细胞的蛋白质表达谱数据库,为深入探究施万细胞的生物学特性和相关研究的进一步开展提供了基础。方法:1、从大鼠坐骨神经中分离施万细胞,使用阿糖胞苷和补体杀伤的方法进行纯化培养。2、收集施万细胞蛋白质,Bradford法测定总蛋白浓度。3、蛋白样品经丙酮沉淀,酶解。4、Nano LC-MS/MS分析,Protein Pilot 3.0软件鉴定施万细胞蛋白质表达谱。5、通过检索Uniprot蛋白数据库和Pub Med数据库对所获得的蛋白表达谱进行生物学功能注释,并采用IPA软件进行蛋白的亚细胞定位分析。6、q RT-PCR方法验证施万细胞表达谱中与自噬等功能相关蛋白的基因表达。7、Western blot和免疫细胞化学染色验证CNP、GFAP、NGFR、TUBB3、NEFM和ATG5在施万细胞中的表达。结果:1、培养获得的原代施万细胞纯度达到95%以上。2、质谱分析鉴定1232个蛋白质(FDR<0.1%)。3、鉴定的蛋白质根据生物学功能分类,包括:转录、信号转导、神经发生和神经发育、代谢、免疫和炎症反应、细胞外基质、细胞骨架、伴侣蛋白、细胞增殖和迁移、氧化应激、凋亡、轴突和突触相关蛋白、细胞周期和细胞分裂、转运蛋白、细胞粘附、细胞自噬、施万细胞标志物和其他功能蛋白。蛋白质亚细胞定位分析结果显示49.7%的蛋白质定位在胞浆中,11.9%在细胞膜上,16.2%在细胞核中,4.6%在细胞外,17.6%定位不明。4、q RT-PCR结果显示所验证的ATG5等21个蛋白的基因在施万细胞中表达。5、Western blot和免疫细胞化学染色结果显示CNP、GFAP、NGFR、TUBB3、NEFM和ATG5在施万细胞中表达。结论:1、在建立大鼠施万细胞蛋白表达谱研究方法的基础上,获得其表达谱数据库,为深入探究施万细胞的生物学特性和相关研究的进一步开展提供了基础。2、发现施万细胞表达与转录、信号转导、神经发生和神经发育、代谢、免疫和炎症反应、细胞外基质、细胞骨架等功能相关的蛋白。3、发现原代培养的大鼠施万细胞表达神经元的标志物NEFM、TUBB3以及和自噬功能相关的蛋白质。第二部分施万细胞分泌蛋白谱目的:本研究拟在建立原代培养的大鼠施万细胞分泌谱研究方法的基础上,获得其分泌蛋白表达谱,为进一步深入探讨施万细胞生物学功能提供实验依据。方法:1、从大鼠坐骨神经中分离施万细胞,使用阿糖胞苷和补体杀伤的方法进行纯化培养。2、台盼蓝染色检测细胞存活率,确定施万细胞条件培养基(Condition Medium,CM)的收集时间。3、收集施万细胞无血清培养8h的条件培养基,超滤浓缩,Bradford法测定总蛋白浓度,SDS-PAGE电泳检测蛋白样品的质量。4、蛋白样品经丙酮沉淀,酶解。5、Nano LC-MS/MS分析,Protein Pilot 4.0软件鉴定施万细胞蛋白质分泌谱。6、通过检索Uniprot蛋白数据库、GO分析和Pub Med数据库对施万细胞分泌蛋白谱进行生物学功能注释和亚细胞定位分析。7、q RT-PCR验证施万细胞分泌蛋白谱中39个蛋白的基因表达。8、免疫细胞化学染色验证与血管发生相关蛋白Cyr61在原代培养的施万细胞中的表达,CCK8细胞活性检测实验检测Cyr61 si RNA干扰施万细胞后对其增殖能力的影响。结果:1、质谱分析共鉴定了615个蛋白质(FDR<0.1%)。2、鉴定到的蛋白质根据生物学功能分类,包括:细胞死亡、细胞运动、细胞形态、细胞迁移、细胞的生存、坏死、凋亡、骨架的组织、器官的炎症、细胞的侵袭、转移、血管的发育、血管发生、神经系统的形态、神经突起发生、神经突起的生长、神经细胞的增殖、自噬、轴突导向和轴突发生等。蛋白质亚细胞定位结果显示:23.58%的蛋白在细胞外的外泌体中,21.30%的蛋白在细胞质中,15.77%的蛋白在细胞核内,14.31%的蛋白在细胞外间隙,13.66%的蛋白在细胞溶质中,9.27%的蛋白在细胞膜上。3、q RT-PCR结果显示分泌蛋白谱中验证的Cyr61等39个蛋白的基因在施万细胞中表达。4、施万细胞表达Cyr61,其表达抑制可影响施万细胞的增殖能力。结论:1、在建立原代培养的大鼠施万细胞分泌蛋白谱研究方法的基础上,获得其分泌蛋白表达谱。2、发现施万细胞可分泌与细胞死亡、细胞运动、细胞形态、细胞迁移、细胞的生存、坏死、凋亡、骨架的组织、器官的炎症等功能相关的蛋白。3、发现施万细胞可分泌与血管发生和发育、细胞侵袭和转移相关的一些蛋白,其中发现Cyr61表达抑制可影响施万细胞的增殖能力。第三部分感觉与运动施万细胞蛋白质表达谱的比较目的:神经系统分为中枢神经系统和外周神经系统,外周神经存在有差异功能的感觉和运动神经。有研究提示外周神经中施万细胞也可能存在感觉和运动亚型并发挥不同的功能,但是它们之间的差异尚不明了。本实验采用i TRAQ标记结合纳流液质联用(Nano LC-MS/MS)的定量蛋白质组学技术,分析小鼠感觉与运动施万细胞蛋白质表达谱的差异,为进一步揭示感觉与运动施万细胞的生物学功能差异,探讨感觉和运动神经损伤后特异性再生的生物学机理提供科学依据。方法:1、转基因小鼠Tg(S100B-EGFP)1Wjt的培育和鉴定。2、根据解剖学结构分离转基因小鼠的感觉与运动神经,分别消化成细胞后培养3天。3、流式细胞仪分选感觉和运动施万细胞,收集细胞总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳检测蛋白样品的质量。4、蛋白质样品经丙酮沉淀,酶解,i TRAQ标记后,分级纯化。5、标记的样品用Nano LC-MS/MS分析,Protein Pilot 4.0软件鉴定所获得的蛋白质。6、通过检索Uniprot蛋白数据库、IPA和Pub Med数据库对差异表达蛋白进行生物学功能注释和亚细胞定位分析。7、q RT-PCR验证部分差异蛋白基因在感觉与运动施万细胞中的表达。8、Western blot和免疫细胞化学染色验证部分差异表达蛋白在感觉与运动施万细胞中的表达。结果:1、流式细胞仪分选获得高纯度的感觉和运动施万细胞。2、质谱检测共鉴定6541种蛋白质(Unsued≥1.3),其中有108个显著差异表达蛋白(Fold change≥2.0或Fold change≤0.5),占所鉴定蛋白质的1.65%,85个在感觉施万细胞中高表达,23个在运动施万细胞中高表达。3、85个感觉施万细胞高表达蛋白的生物学功能分类,包括:蛋白合成、泛素蛋白、伴侣蛋白、细胞增殖、细胞周期和分裂、能量代谢、视黄醇代谢、细胞骨架、转运、细胞分化、生长和发育、凋亡、表观抑制、转录、免疫功能、细胞粘附、血小板生长因子受体信号通路、蛋白结合、神经生长和发生和其它等功能。23个运动施万细胞高表达蛋白生物学功能分类,包括:神经发生、骨架、自噬、蛋白结合、发育、细胞增殖、细胞迁移、染色体稳定、胶原代谢、轴突导向和其它等功能。4、部分感觉与运动施万细胞差异表达蛋白基因的q RT-PCR验证结果与蛋白质组学检测结果基本一致。5、Western blot和免疫细胞化学染色结果显示CNP,GAP43和GMFB在感觉施万细胞中高表达,His1h4a在运动施万细胞中高表达,结果与蛋白质组学结果一致。结论:1.通过蛋白质组学方法比较了感觉和运动施万细胞的蛋白质表达谱,发现两种施万细胞的蛋白表达谱存在差异。2.通过生物信息学方法分析得到108个差异表达蛋白,其中85个为感觉施万细胞高表达,主要功能为蛋白合成、能量代谢、转录、生长和发育等。23个在运动施万细胞中高表达,主要功能为染色体稳定和细胞外基质等。