乳腺癌是临床上一种常见的恶性肿瘤,且无论是在发展中国家还是发达国家都高居女性因肿瘤死亡原因的前列。在我国,自从上世纪九十年代以来,国民经济水平有了重大发展,老百姓的生活水平普遍有了较大提高,人民的生活方式也随之产生了显著改变,而同时乳腺癌在我国很多地区的发病率却不断提高。当前医疗技术和水平与以往相比有了巨大提高,但临床上针对乳腺癌的有效治疗手段依然有限:外科手术切除依然是临床上治疗乳腺癌的一项最主要的治疗方案,但患者术后肿瘤转移和复发率很高;目前对乳腺癌的辅助治疗方案主要包括放射治疗和化学药物治疗等疗法,但这些治疗方案普遍对患者有不同强度的副作用,甚至对正常机体功能有严重影响。因此,如何能深入探究乳腺肿瘤的发生和发展的分子作用机制,研发新的早期诊断标记和开发相应的有效治疗方案对临床上乳腺癌的治疗具有及其重要的价值。C2ORF40(chromosome 2 open reading frame 40),別名 esophageal cancer related gene 4或proaugurin,是一种高度保守的基因,其最早的研究报道见于1998年科学家对食管癌的研究,目前对其相关研究和认识还很局限。近年来研究人员发现,C2ORF40可能足一种候选抑癌基因,不断有研究结果证实其在诸多细胞生物学进程中能够发挥重要的调控作用,包括肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等。近来研究结果表明C2ORF40转录水平在许多肿瘤疾病中发生了明显下调,包括食管癌、前列腺癌、结肠癌和神经胶质瘤等,并且临床研究证据发现这种转录水平下调与肿瘤病人预后有十分密切的关联。C2ORF40被视为一种重要的抑癌基因,但目前对其在肿瘤中的蛋白表达水平及临床意义少有研究报道。同时,细胞周期调控紊乱是恶性肿瘤的一项重要基本特征,能够导致肿瘤细胞增殖活力大大增强,且肿瘤恶性程度不断加重。因而,对细胞周期及其相关调控基因的深入研究有助于阐明肿瘤如何发生与其发展的分子机制,并有助于发现针对肿瘤进行早期有效筛查和诊断的相关的分子标记物,为治疗临床上肿瘤疾病提供坚实的科研基础。目前,C2ORF40被广大学术界视为一种潜在的抑癌基因及重要的治疗靶点,但是其在乳腺肿瘤中的具体作用及分子机制还未明确。本课题经研究发现在乳腺癌患者临床病例组织中C2ORF40蛋白表达水平发生了显著降低,且进一步研究发现C2ORF40表达水平和肿瘤中很多重要的临床病理学特征有十分紧密的关联。同时,研究发现C2ORF40基因能够编码148个氨基酸组成的蛋白产物,并且这种蛋白包含能够被弗林蛋白酶或凝血酶所特异性识别位点,能够经被相应的蛋白酶剪切处理从而生成多种小分子多肽。已有研究证实在某些细胞条件培养基中能够检测到这些分泌的小分子多肽,并且获得的这种条件培养基上清液具有抑制细胞增殖的能力。但目前还没有关于来源于C2ORF40基因的小分子多肽能否作用于乳腺癌的研究报道。本论文发现一种C2ORF40衍生物,其作为小分子多肽来源于C2ORF40基因并经凝血酶剪切处理生成,有着明显的抗肿瘤活性,我们通过体外实验研究发现,这种源于C2ORF40的衍生物能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖能力、侵袭和转移能力。更重要的是,我们对于C2ORF40如何发挥抗肿瘤作用的分子机制进行了深入探究,研究结果证明C2ORF40能够通过调控重要的有丝分裂基因,显著影响细胞周期进程,在有丝分裂进程产生障碍,以阻碍乳腺癌细胞的生长,从而发挥其抗肿瘤功能。本研究课题主要探索了C2ORF40及其衍生物对乳腺癌的抗肿瘤作用,并对可能的分子机制进行了深入研究。该项研究不仅进一步阐明了 C2ORF40的生物学功能,并对其分子作用机制进行了深入研究,同时为开发临床上针对乳腺癌新的诊断指标和研发新的有效治疗方案提供了研究靶点。第一部分C2ORF40与乳腺癌临床病理特征的相关性研究[目的]检测临床上乳腺癌病人病例组织样本中C2ORF40的表达水平,并进一步探究乳腺肿瘤病人病例组织中C2ORF40表达水平与相关临床病理特征间的关联,明确C2ORF40在乳腺癌中的临床意义,同时为更全面探索C2ORF40在乳腺癌中的作用及机制奠定科学基础。[方法]1.收集山东大学齐鲁医院乳腺外科手术切除的乳腺癌组织及其相对应对应的癌旁组织,分别经qRT-PCR实验测C2ORF40在乳腺肿瘤组织及相应的癌旁组织中转录水平,经Western blot实验检测乳腺肿瘤组织及其癌旁组织中C2ORF40蛋白水平。2.采用Alenabio生物科技公司的乳腺癌组织芯片(BC081116C),应用免疫组化染色实验来对正常乳腺组织、原位乳腺癌组以及有转移的乳腺癌组织中C2ORF40蛋白表达水平进行检测,并进一步通过统计学方法分析C2ORF40表达水平与患者年龄、肿瘤转移、分化程度及其TNM分期等乳腺癌病理特征之间的关联。[结果]1.采用qRT-PCR实验检测C2ORF40在乳腺肿瘤组织及其相应的癌旁组织中转录水平,结果显示与乳腺肿瘤癌旁组织相比,C2ORF40转录水平在乳腺肿瘤组织中显著降低。2.采用Western blot实验对C2ORF40在乳腺肿瘤组织及其相应的癌旁组织中的蛋白表达水平进行检验,结果表明与相应的乳腺癌旁组织中C2ORF40蛋白表达水平相比,肿瘤组织中C2ORF40表达水平发生了明显降低。3.取乳腺癌组织芯片经免疫组化染色实验检验C2ORF40蛋白在正常乳腺组织、原位乳腺癌组织以及有转移的乳腺癌组织中表达情况,结果表明C2ORF40蛋白于正常乳腺组织中表达水平较高,在原位肿瘤组织中C2ORF40蛋白表达水平发生明显下调,而在发生转移的乳腺肿瘤组织中C2ORF40蛋白水平最低。统计学分析发现,C2ORF40表达水平与乳腺肿瘤转移、肿瘤分化程度及TNM分期等临床病理学特征紧密相关。[结论]1.在正常乳腺组织中C2ORF40转录水平和蛋白表达水平明较高,而其表达情况在肿瘤组织中则则发生了显著下调,提示C2ORF40在乳腺肿瘤中属于抑癌基因。2.免疫组化实验数据证实,与正常乳腺组织中C2ORF40蛋白表达情况相比,原位癌组织中C2ORFR40表达发生明显下调,在有转移的乳腺肿瘤组织中其表达水平最低。进一步分析表明乳腺癌患者C2ORF40表达水平且与其相应肿癌临床病理特征密切相关。第二部分C2ORF40及其衍生物抗肿瘤作用研究[目的]第一部分临床病例研究表明C2ORF40在乳腺癌中表达水平降低,且与乳腺肿瘤转移、分化程度及其TNM分期等紧密相关。本部分我们通过体外实验和体内异种移植瘤模型深入研究C2ORF40及其衍生物抗肿瘤作用及其作用机制。[方法]1.通过生物科技公司Synpeptide(Shanghai,China)合成C2ORF40衍生物即小分 子多肽 C2ORF40 mimic peptide(C2ORF40MPF)及其对照 Scrambled C2ORF40 mimic peptide(ScrC2ORF40)。2.应用乳腺癌细胞和肺癌细胞,通过MTT实验和克隆形成实验检测C2ORF40MPF多肽对肿瘤细胞增殖能力的作用。3.应用乳腺癌细胞,通过Transwell迁移实验检测C2ORF40MPF多肽对肿瘤细胞迁移能力的作用。4.应用乳腺癌细胞,采用Matrigel侵袭实验检测C2ORF40MPF多肽对肿瘤细胞侵袭能力的作用。5.应用动物实验,经MDA-MB-231细胞系建立裸鼠移植瘤模型,并给予C2ORF40MPF多肽进行治疗,从而通过体内实验进一步验证C2ORF40MPF能否抑制乳腺肿瘤的生长。6.构建C2ORF40基因过表达质粒(pBabe-C2ORF40),经逆转录病毒转染pBabe-C2ORF40及其对照空白质粒,我们前期研究发现乳腺癌细胞系BT549和MDA-MB-231中C2ORF40表达水平较低,从而选用上述细胞系来构建稳定高表达 C2ORF40 的细胞株及其对照细胞株(BT549-pBabe,BT549-pBabe-C2ORF40,MDA-MB-231-pBabe,MDA-MB-231-pBabe-C2ORF40)。应用嘌呤霉素进行筛选,然后采用RT-PCR和Western blot方法来验证我们所建立的细胞系中C2ORF40的mRNA水平和蛋白表达水平。7.应用以上筛选获得的稳定过表达C2ORF40的BT549和MDA-MB-231细胞株及相应空白对照细胞,采用流式细胞术实验来检测C2ORF40是否调控肿瘤细胞周期。8.应用C2ORF40稳定高表达及其空白对照乳腺癌细胞株,将细胞周期同步化技术与流式细胞术方法相结合,更深入阐明C20RF4是如何调控细胞周期。9.采用乳腺癌细胞系经流式细胞术实验检测C2ORF40MPF多肽是否对肿瘤细胞周期有作用;并将细胞同步化技术与流式细胞术实验相结合,从而更深入阐明C2ORF40MPF多肽细胞周期的调控作用。10.应用稳定高表达及其空白对照C2ORF40的乳腺癌细胞株,通过免疫荧光染色实验来检测过表达C2ORF40对有丝分裂进程的具体作用。[结果]1.成功构建并合成C2ORF40衍生物C2ORF40MPF及其对照ScrC2ORF40。2.MTT实验结果和克隆形成实验结果显示,C2ORF40MPF多肽可以显著抑制乳腺癌细胞和肺癌细胞的增殖能力。3.Transwell迁移实验表明C2ORF40MPF多肽能够明显抑制肿瘤细胞迁移。4.Matrigel侵袭实验结果表明C2ORF40MPF可以明显抑制肿瘤细胞侵袭能力。5.异种移植瘤实验证实C2ORF40MPF能够在体内明显抑制乳腺肿瘤的生长。6.成功构建过表达C2ORF40的质粒(pBabe-C2ORF40),并获得稳定转染C2ORF40 的乳腺癌细胞 BT549 和 MDA-MB-231(分别命名:BT549-pBabe,BT549-pBabe-C2ORF40;MDA-MB-231-pBabe,MDA-MB-231-pBabe-C2ORF40)。通过 RT-PCR和Western blot实验验证以上细胞系确实得构建成功。7.应用C2ORF40稳定高表达及其空白对照细胞株,流式细胞术实验结果表明高表达C2ORF40使细胞周期后朋中G2/M期增多。8应用C2ORF40稳定高表达及其空白对照乳腺癌细胞株,将细胞同步化处理与流式细胞术方法相结合,结果显示C2ORF40诱导产生有丝分裂阻滞。9.流式细胞术实验结果证实C2ORF40MPF多肽能明显增加肿瘤细胞G2/M期比例再将细胞同步化实验与流式细胞术实验结合进一步证实其对细胞周期阻滞作用。10.应用C2ORF40稳转乳腺癌细胞系,免疫荧光实验结果表明C2ORF40将细胞周期阻滞在有丝分裂前中期并造成多核细胞生成增多,该项结果有力证实了C2ORF40对有丝分裂的阻滞作用。[结论]1.C2ORF40及其C2ORF40衍生物对细胞周期有调控作用,通过将细胞周期阻滞在有丝分裂前中期并造成多核细胞增多,干扰细胞有丝分裂过程,对肿瘤细胞生长产生抑制作用。2.C2ORF40衍生物能够有效抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力。第三部分C2ORF40调控细胞周期的分子机制研究[目的]以上研究表明C2ORF40在乳腺癌中具有明显的抗肿瘤作用,且在肿瘤细胞周期进程中发挥了明显的调控作用,但是其作用机制尚不明确,本部分我们通过一系列实验深入探究C2ORF40抗肿瘤作用的具体分子机制。[方法]1.利用GEO基因表达数据库经过生物信息学技术分析C2ORF40可能的靶基因;应用我们建立的稳定过表达C2ORF40的肿瘤细胞株其空白对照细胞,通过qRT-PCR实验方法验证上述分析结果。2.应用建立的过表达C2ORF40的乳腺癌细胞系及其空白对照细胞株,通过Western blot实验方法来检测C2ORF40对有丝分裂基因的影响。3.构建BIRC5高表达质粒(p3xflag-cmv-10-BIRC5),在高表达C2ORF40乳腺癌细胞系中转染BIRC5质粒,经RT-PCR和Western blot实验验证BIRC5的表达水平变化;进一步经流式细胞术实验验证BIRC5是否能改变C2ORF40对细胞周期的影响。4.通过Alenabio生物科技公司的乳腺癌组织芯片(BC081116C),采用免疫组化染色实验来检测BIRC5蛋白在正常乳腺组织、原位肿瘤组织以及有转移的乳腺癌组织中表达情况的变化,并进一步经统计学方法分析其表达水平与对应标本中C2ORF40表达水平之间的相关性。[结果]1.经生物信息学分析发现C2ORF40的作用基因大部分是重要的有丝分裂相关基因。2.经qRT-PCR和Western blot实验验证,C2ORF40能够降低有丝分裂基因BIRC5的表达水平;流式细胞术实验证实在乳腺癌细胞中回调BIRC5水平能够部分逆转C2ORF40引起的细胞周期阻滞作用。3.组织芯片的免疫组化实验数据表明,与正常乳腺组织相比,BIRC5在肿瘤组织中表达水平显著上调,且统计学分析研究结果发现C2ORF40的表达水平和BIRC5的表达水平呈明显负相关。[结论]1.C2ORF40能够抑制有丝分裂基因BIRC5的表达。2.BIRC5能够介导C2ORF40抑制细胞周期进程的作用。