内皮细胞的种植可明显提高人工血管的远期畅通率和人工血管、人工心脏瓣膜的抗血栓形成能力，在临床上应用日益增加。血管内支架作为心血管植入材料的一种，在降低经皮穿刺血管球囊成形术再狭窄发生率的同时，也存在着血栓形成和支架内再狭窄的问题。血栓形成主要是因为内皮损伤和支架的异物源性，支架内再狭窄形成主要是因为内膜增生。如果在血管内支架表面种植内皮细胞，理论上有可能防止或降低血栓形成和支架内再狭窄发生，因此加强这方面的基础研究具有非常重要的临床应用价值。但在血管内支架的内皮细胞种植修饰上还有很多问题有待解决。本研究针对血栓形成和支架内再狭窄发生机理，通过转基因手段加强拟用于种植的内皮细胞的功能，体外研究在模拟体内循环系统下种植的内皮细胞的改变，为进一步研究血管内支架的内皮细胞种植奠定基础，从而为心血管疾病的防治并为心血管材料组织工程化研究提供理论基础。 1 脂质体介导血管内皮细胞生长因子转染人脐静脉内皮细胞（ECV-304）系的建立及血管内皮生长因子转染对内皮细胞功能影响 目的：建立稳定表达血管内皮生长因子（VEGF）的人脐静脉内皮细胞系，检测血管内皮生长因子转染后对内皮细胞生长增殖、形态结构和一氧化氮分泌的影响。方法：提取、纯化已构建好的真核表达载体PCD2-VEGF121，酶切鉴定正确后，用阳离子脂质体介导，转染人脐静脉内皮细胞系细胞ECV-304，经G418筛选，获得G418抗性单克隆细胞，扩增后用RT-PCR检测其外源VEGF基因的转录、细胞免疫组织化学方法检测其VEGF蛋白质的表达、Miles实验检测其培养上清液中VEGF的生物学活性。比较转染前后细胞形态和细胞骨架纤维的改变，绘制细胞生长曲线比较转染对细胞分裂增殖的影响，收集细胞培养基，测定转染前后内皮细胞一氧化氮分泌水平。结果：RT-PCR检测出了转录VEGF121的稳定转染细胞克隆，该单克隆细胞的免疫组化检测VEGF蛋白质表达结果呈阳性，Miles实验结果表明其培养上清液中的表达产物具有强大的生物学活性，而作为对照的转空白质粒细胞和未转染细胞上述实验结果皆为阴性。细胞由转染前大部分为鹅卵石形转变为转染后大部分为长梭形，细胞骨架纤维无明显变化；转染细胞倍增时间缩短；一氧化氮分泌均在传代培养24小时达到高峰，48和72小时时转染细胞一氧化氮水平明显高于正常细胞且差别显著，24和96小时时两者水 中南人学博十学位论文 摘要平差别不明。结论：1．成功建立稳定表达有生物学活性的VEGF蛋白的人源忖单克隆内皮细胞系：2．仆W转染促进了内皮细胞自身生长增殖，增加一氧化氮的分泌，使细胞形态向有助于稳定粘附的方向改变。2 促进内皮细胞粘附和保留的底物筛选 目的：筛选促内皮细胞粘附和保留的底物。方法：分别用0、1、5、10、20 119加 的 Poly－1－lySlflfl、CollagenIV、FibroflflCtln包被96孔板，加入等量内皮细胞悬液，静置Zh，PBS漂洗，显微镜下每孔计数四视野细胞数目，与未用底物包被的空白对照计算相对粘附比后进行比较。分别应用X射线荧光能谱仪和扫描电镜等获取血管内支架理化性状。M用 Fibronectin和 Poly－1－lysine处理血管内支架，扫描电镜观察底物在支架上的覆盖情况。旋转进行内皮细胞种植，细胞悬液总数为 9 X 10’，细胞悬液密度为 4．5 X 10‘加，每 10min旋转一次，旋转lh，再静置lh后取出支架。消化支架上细胞进行计数，计算内皮细胞在支架上粘附的绝对细胞数目，比较2种底物对促内皮细胞粘附到支架上的能力，并用扫描电镜观察细胞在支架上的粘附情况，内皮细胞在支架上的生长情况被观察。最优粘附能力浓度的pOly－1一lySlfle、COil。geflw、FibrofleCtifl包被平板后种植内皮细胞，在细胞生长融合成单层后置于平行平板流动腔中，应用 21 dyn／Cm’剪切力作用24小时，收集内皮细胞进行计数，正常培养内皮细胞计数作为对照，计算保留率。然后选择Po ly刁lsine作为底物，应用42uyn八mz剪切力作用M，J’时，计算细胞保留率。结果：三种底物都可以促进内皮细胞的粘附，其中以Polyll 相对粘附比为最高，Fibronectin次之，CollagenIV最低。支架总表面积为Z10Inln，粗糙度为 0·5 P m。Flbronectin、Poly－L－lysine处理后粘附底物在血管内支架上形成一完整的覆盖层，卜ibronectin、poly－L一lysine 处理支架与裸支架上绝对粘附细胞数目分别为门．39士 1．84)XIO’、门．25士 1．sl)X 10’、门．25士 1．05)X 10‘，单位表面积上粘附细胞数目为门．6110．SS)X 10‘／cm’、（1．55士0．86）X 107Cm‘、（0．60士0．50）X 10‘／Cm‘，内皮细胞在底物处理组和未处理组支架卜生长状况存在明显差异。在内皮细胞保留率方面，Zldyn／Cm’作用 24h后，裸平板为门．50上2．08)％，Poly－llysine为（90．38士2．09）％，CollagenIV为（19．77土 1．05）％，Fibronectin为（gi．59士1．24）％。Poly－llysine为底物，42 dyn／Cm‘剪切力作用 24h后内皮细胞保留率为Q6．58士 1．98仰。结论：1．