第一部分CAPE对培养的血管平滑肌细胞生长的影响目的:观察不同浓度的咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester CAPE)对脂多糖(lipopolyccharide LPS)激活的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)生长情况的影响。方法: DMEM细胞培养基中加入不同浓度药物为试验组,不加者为对照组。用MTT比色法描述不同浓度LPS作用VSMCs 72h内的生长情况,及CAPE对一定浓度LPS(1mg﹒L-1)激活VSMCs 120h的影响;通过平板克隆实验观察LPS和CAPE作用3周对细胞增殖的影响;细胞免疫化学法用于检测CAPE作用72小时后VSMCs表达PCNA情况。结果:1不同浓度LPS对VSMCs生长的影响0.1-10 mg﹒L-1 LPS实验组O.D值较对照组明显升高,表明一定浓度范围内的LPS能增强VSMCs增殖。5.10.20.40.80 mg﹒L-1CAPE作用VSMCs(1mg﹒L-1 LPS刺激)后具有显著抑制细胞的增殖作用,且呈时间和剂量效依赖关系。2平板克隆实验一定浓度范围的LPS作用于VSMCs3周可明显增加细胞克隆的形成,而CAPE明显抑制细胞克隆的形成。CAPE浓度越高,形成的克隆数就越少;3 CAPE对VSMCs中PCNA蛋白表达的影响PCNA蛋白阳性反应定位在细胞核或核膜,呈棕黄色或棕褐色。VSMCs经0-10 mg﹒L-1 LPS刺激时,各实验组PCNA逐渐增高,与对照组比较有显著差异;经不同浓度CAPE处理后,PCNA阳性率由对照组的91.8%±1.7%逐渐降低为最高CAPE浓度组的40.0%±1.8%(p<0.01)。4药物溶剂DMSO对VSMCs增殖没有显著影响。结论:通过MTT试验,细胞克隆形成试验以及PCNA蛋白检测试验,发现LPS作为刺激因子可显著激活VSMCs体外培养时的生长,在一定浓度范围内与LPS的剂量呈以来关系。同时试验还发现作为干预因素,CAPE可显著抑制LPS激活的VSMCs的生长,并与药物的作用时间和剂量相关。试验显示CAPE抑制细胞生长与PCNA阳性表达率降低有关,提示抑制细胞周期相关蛋白的表达可能是其作用机制之一。第二部分CAPE影响培养的VSMCs生长的机制目的:探讨不同浓度的CAPE抑制激活的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)生长情况的机制。方法:采用ELISA法检测细胞培养基上清液中IL-6, TNF-α等细胞因子。流式细胞仪检测CAPE对VSMCs细胞周期的变化和凋亡的影响;采用凝胶迁移或电泳迁移率检测法(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)检测核转录因子-κB(nuclear factor of kappa B,NF-κB)在平滑肌细胞中的活性;实时定量PCR技术用于检测细胞中Sur(survivin,存活素),Bcl-2及Bax表达水平的变化。结果:1 LPS导致细胞培养液中IL-6,TNF-α皆有升高,并且随着LPS浓度的增加IL-6,TNF-α的浓度升高;同时随着LPS刺激时间的延长,细胞因子的浓度也升高。而CAPE对有一定浓度刺激的VSMCs产生的IL-6,TNF-α有抑制作用,其抑制效果与CAPE的浓度和作用时间有关。2细胞周期分析表明5-20mg﹒L-1 CAPE处理VSMCs 24 h后,对照组实验组G0/G1期细胞百分率明显升高;S期细胞百分率由对照组的32.4%±2.6%逐渐下降20 mg/L组的11.2%±1.4%,呈剂量依赖性(p<0.05)。3流式细胞仪发现5-20 mg﹒L-1 CAPE作用VSMCs 24h后,细胞的凋亡率分别为(10.1%±0.7%,18.9%±1.3%,27.3%±2.4%)显著高于对照组(4.2%±0.3%)(P<0.05),且凋亡细胞随CAPE剂量的增加逐渐增多。4 EMSA实验发现LPS使平滑肌细胞中NF-κB活性增加,而CAPE则可显著抑制其活性。5不同浓度LPS和CAPE对细胞表达mRNA的影响相反。LPS增加细胞在表达抗凋亡的相关mRNA,同时抑制促进凋亡的相关mRNA表达。而CAPE的作用则相反。CAPE各组细胞表达Bax mRNA水平升高,Sur和Bcl-2 mRNA表达水平与对照组比较明显下降。结论: CAPE使处于G0/G1期的细胞增加S期的减少同时CAPE促进细胞凋亡;ELISA和EMSA试验表明CAPE对细胞因子的影响;同时CAPE还使细胞表达抗凋亡基因降低,促凋亡基因表达增加。这些证据表明一定剂量范围的CAPE可能是通过调节细胞周期,影响细胞释放细胞因子,干预NF-κB活性以及细胞凋亡相关基因的表达等多个机制和手段抑制体外培养的VSMCs增殖的。第三部分CAPE对大鼠颈总动脉球囊扩张术后内膜增生的影响及其机制目的:为探索RS的发病机制并进行干预研究,我们模拟复制大鼠颈总动脉内膜损伤后不同时间点的VSMCs增殖和血管重塑动态变化模型,并探讨CPAE对血管内皮损伤诱发的VSMCs增殖的抑制作用及对活体大鼠表达Sur, Bax, Bcl-2等凋亡相关基因的影响。方法:建立雄性SD大白鼠(体重300~350g)颈动脉损伤的动物模型,动物随机分为:假损伤组( sham - injured group,S组)、损伤组( injured group,I组)和损伤+ CAPE治疗组( injured +20 mg kg -1CAPE - treated group,CAPE组)。采用HE染色法弹力显微染色法检测3、7、14、28d血管形态学改变,计算机图像分析系统检测新生内膜厚度(H),新生内膜面积(NIA),中膜面积(MA),内弹力板围绕面积(IEM)、外弹力板围绕面积(EEM)、各组血管腔面积(lumen area,LA)并计算新生内膜面积/中膜面积(NIA/MA)、管腔狭窄指数(NIA/IEM);免疫组织化学SABC法检测I组和CAPE组血管壁细胞中Sur、Bax和Bcl-2蛋白的表达,计算机图像分析蛋白表达的平均光密度值。TUNEL法检测细胞凋亡率。ELISA法检测血清中IL-6, TNF-α等细胞因子。EMSA实验用于检测血管壁细胞中NF-κB活性。实时定量PCR检测血管壁Sur,Bax及Bcl-2 mRNA的表达水平。结果:1 S组大鼠总动脉内膜仅见单层内皮细胞;I组球囊损伤后3d血管腔内表面可见增殖的VSMCs, 14d内新生内膜(neointima,NI)形成并厚度增加,同时细胞外基质( extracellular matrix,ECM )也逐渐增加。14d时中膜面积明显大于未损伤血管。LA 14d以后明显小于未损伤侧。损伤后3 ~ 7 d NIA/MA,NIA/IEM至14 d达最大。CAPE组各项指标与I组比较有相反的变化趋势。2 S组血管壁组织细胞中的Sur,Bcl-2和Bax蛋白表达水平相对较低。I组的Sur蛋白水平术后14天内持续升高,在28天时发现其表达水平较第14天降低;Bcl-2蛋白表达水平一直升高;Bax蛋白术后也升高,7d后开始下降。CAPE组Sur,Bcl-2蛋白水平较I组降低,但Bax蛋白较I组升高。3 S组血管TUNEL染色未见阳性着色;球囊损伤后TUNEL阳性细胞先增多后减少。CAPE使细胞凋亡率增加,其作用随时间的延长而加强。4 S组术后IL-6和TNF-α逐渐升高。I组细胞因子血清比S组显著升高,与S组相比差异显著(P<0.01); CAPE组术后6h血清TNF-α含量与I组相比显著降低(P<0.01)5 EMSA实验发现S组血管组织中未见NF-κB活性,I组中NF-κB活性在48h内持续升高,之后开始下降至损伤即可水平而CAPE则可显著抑制其活性。6实时定量RT-PCR表明S组血管壁组织细胞中的Sur,Bcl-2和Bax mRNA表达水平相对较低。I组中mRNA的变化趋势与其蛋白表达的变化相似。CAPE组Sur,Bcl-2 mRNA水平较I组降低,但Bax mRNA升高明显。结论: CAPE能显著抑制球囊扩张术后血管内膜增生,其作用效力与药物的作用时间有关。药物的作用机制可能与一定量的CAPE导致细胞生存相关的基因表达发生改变,使Sur,Bcl-2等促使细胞增生的基因表达降低,同时调节Bax等促使细胞凋亡的基因高表达等机制有关;另外,实验还发现CAPE能调节实验动物血清中细胞因子的水平,这也可能是其作用机制之一。