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研究目的通过分子生物学的方法从苦瓜中克隆和表达了MAP30,并对其在哺乳细胞内的转运途径和抗病毒机制进行了初步的研究,旨在揭示其抗病毒和抗肿瘤作用的机制。研究方法从成熟苦瓜种子中提取其基因组DNA,通过PCR的方法扩增出MAP30基因的全长,并将其连入原核表达载体pET30a,转入E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达3-5 h,离心收集菌液,超声破碎分析上清和沉淀,并选用Ni-NTA进行亲和纯化。于浙江大学动物房购买健康的新西兰雄兔2只,用免疫学方法制备MAP30的多克隆抗体,初次免疫用1 mg MAP30和等量的弗氏完全佐剂,再次免疫用0.5 mgMAP30和等量的弗氏不完全佐剂每隔两周免疫一次,一共四次。免疫前,兔子耳缘静脉采血,分离血清为对照,免疫后血清ELISA法测抗体的效价,Western blot测抗体的特异性。采用MTT方法检测MAP30对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤作用,并用此方法比较MAP30对转入HBV的HepG2细胞和其原型HepG2细胞的细胞毒性。分析MAP30、天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)、拉米夫定对HepG2.2.15的细胞毒性,选取其对细胞毒性最小的浓度范围进行HBV抑制的体外实验。ELISA方法检测MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg的抑制作用,Real-time PCR方法检测其对HBV DNA的抑制作用。并在不同离子作用下,检测MAP30对DNA的切割作用。免疫电镜的方法观察MAP30在哺乳动物细胞内转运途径。研究结果通过PCR方法克隆出MAP30的基因,测序结果与文献报导的相符。通过IPTG诱导表达,得到了一条分子量约为34 kD的目的条带,以可溶性和包涵体两种形式表达,可溶性含量较多。上清经过镍柱亲和纯化,用不同浓度梯度的咪唑进行洗脱,在100 mM咪唑中洗脱下较纯的MAP30,透析除去咪唑,Bradford法测浓度后,过滤除菌,-20℃保存。ELISA法测抗体的效价为128000,Western blot测抗体的特异性发现除了34kD的目的条带外,还有一条分子量约为MAP30两倍的条带,经检测,其为MAP30的二聚体。MAP30对肿瘤细胞Hela、HepG2的毒性远大于对正常细胞LO2的细胞毒性,SPSS软件计算MAP30对癌细胞HepG2和Hela细胞的IC50分别为8.28μg/ml和6.92μg/ml;对LO2细胞,MAP30的IC50大于400μg/ml。MAP30对转入HBV的HepG2.2.15细胞毒性要小于原型HepG2细胞。在浓度为0.1-100μg/ml下,MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15的细胞毒性均低于15%。在此浓度下,MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA均有抑制,其抑制作用具有剂量依赖性。MAP30能将超螺旋DNA切割成缺口环状或线性DNA,并具有剂量依赖性。在不同离子作用下,MAP30对DNA的切割作用不同。免疫电镜的方法直接观察到了MAP30在细胞内主要集中于细胞核。MAP30作用细胞后,电镜观察到细胞自噬体形成。结论MAP30对肿瘤细胞的毒性大于对正常细胞的细胞毒性。MAP30对转染HBV的HepG2.2.15细胞的毒性要小于原型HepG2细胞的细胞毒性。在低毒性剂量下,MAP30具有抑制HBV的作用,其抑制作用具有剂量依赖性。MAP30进入细胞后,可以运输进入细胞核,从而干扰病毒的复制,其可能的作用机制为MAP30对细胞核内的DNA的切割作用。MAP30作用细胞后,有可能诱导细胞自噬。