论文部分内容阅读
Sansanmycin(SS)是由我国贵州土壤中发现的链霉菌Streptomyces sp.SS所产生的一组尿苷肽类抗生素，此类抗生素家族还包括pacidamycin，napsamycin和mureidomycin等。Sansanmycin对铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis及多重耐药结核分支杆菌具有很好的抑制作用。Pacidamycin和napsamycin的生物合成基因簇已经被克隆， pacidamycin基因簇中大部分生物合成酶的功能和生物合成步骤已经基本阐明，但是关于它们生物合成调控机制尚未报道。
本研究通过全基因组测序和构建大片段基因组文库相结合的方法首次克隆了sansanmycin的生物合成基因簇（ssa），其包含25个开放阅读框，与pacidamycin和napsamycin的生物合成基因簇具有很高的序列相似性。利用HHpred对SsaA进行结构同源性比对分析，结果表明SsaA的N-端含有一个FHA(forkhead-accociated)结构域，C-端含有一个LuxR类型的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH) DAN结合模体，预示着ssaA可能是sansanmycin生物合成转录调节基因。为了对ssaA的功能进行验证，本研究将ssaA的编码区克隆至含有强启动子ermE*p的质粒pL646中，通过接合转移导入野生型菌株中构建过表达菌株SS/pL-ssaA，生物学活性检测和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析结果表明sansanmycin的产量提高了约一倍，提示ssaA为sansanmycin生物合成正调节基因。为了对ssaA的调控功能进行进一步的确证，本研究采用PCR-targeting的方法构建了ssaA的阻断突变株SS/AKO，生物学活性检测和HPLC分析结果表明，SS/AKO不产sansanmycin，而导入ssaA基因可以使其恢复产生sansanmycin的能力，进一步确证ssaA为sansanmycin生物合成正调节基因。
利用实时荧光定量RT-PCR对阻断株SS/AKO中结构基因ssaH，ssaN，ssaP，ssaX，ssaC的转录水平进行分析，结果表明SS/AKO中这些基因的转录水平均明显下降，说明ssaA是通过控制结构基因的转录水平从而控制sansanmycin产量。
本研究利用E.coli BL21(DE3)表达并纯化了N-端融合了His标签的SsaA重组蛋白，进行凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，结果表明SsaA可与基因簇内包括ssaHp，ssaN-Pp，ssaU-Ap，ssaC-Dp，ssaWp在内的多个结构基因启动子区结合，说明SsaA是通过直接结合于结构基因的启动子区从而控制sansanmycin的生物合成的。利用DNaseI足迹法获得SsaA在这些启动子区上的结合位点，通过WebLogo对这些结合位点进行比对，获得了SsaA的一致结合序列GTMCTGACAN2TGTCAGKAC，其特征为含两个9 bp反向重复序列(inverted repeat,IR)，中间间隔2 bp。将一致结合序列进行突变和缺失，利用EMSA检测SsaA与它们的结合能力，结果表明SsaA均不能和它们结合形成复合物，验证了一致结合序列的正确性。
当EMSA实验反应体系中加入浓度逐渐升高的终产物sansanmycin A(SS-A)或sansanmycin H(SS-H)时，SsaA与目标基因启动子区ssaC-Dp和ssaU-A-1p的结合能力逐渐减弱，表面等离子体共振(Surface plasmon resonance，SPR)实验显示SS-A可以抑制SsaA与ssaC-Dp-3的结合，表明sansanmycin对SsaA的DNA结合活性具有调控作用。此外，SPR实验表明SS-A和SS-H可以与SsaA直接相互作用，说明sansanmycin可通过与SsaA相互作用从而改变SsaA的DNA结合活性。
综上所述，本研究首次克隆了sansanmycin生物合成基因簇，通过基因过表达和阻断实验证明ssaA为sansanmycin生物合成正调节基因，并且对ssaA的分子调控机制进行了深入研究，表明SsaA为一类新型转录因子，具有全新的调控机制，通过终产物负反馈调控机制控制sansanmycin的生物合成。