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SUMO(small ubiquitin-like modifier),泛素类似分子家族成员。Sumoylation是蛋白质修饰的一种,与泛素化修饰过程类似,通过级联的酶促反应,将SUMO分子共价交联到目的蛋白的赖氨酸残基上,即完成SUMO化修饰。蛋白质的SUMO化修饰涉及众多的细胞生理和病理过程,包括肿瘤的发生。Ubc9(ubiquitin-like protein SUMO conjugating enzyme9)是SUMO化修饰中唯一的E2结合酶,其结构和功能的异常直接影响细胞蛋白SUMO化水平。已有文献报道,在卵巢癌等肿瘤中存在Ubc9表达升高的现象,提示Ubc9的高表达可能与肿瘤的发生有关。本部分研究中,我们首先选了9例神经胶质瘤样本组织(包括Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级各3例)、4株神经胶质瘤细胞系(T98G、A172、U87MG和U251)和2例正常脑组织,用Western blot的方法检测了Ubc9在其中的表达情况。结果发现,在神经胶质瘤组织中Ubc9的表达高于正常脑组织,且其表达和病理分级相关,病理分级越高,Ubc9表达越高;细胞系中除U87MG外Ubc9的表达均表现为不同程度的升高。Real-timePCR结果表明四株神经胶质瘤细胞系中Ubc9的mRNA表达量与蛋白表达量并不匹配,提示在胶质瘤细胞中存在Ubc9表达的转录后调控机制,miRNA可能参与了Ubc9的表达调控。MiRNAs是一类内源性的非编码RNA,在哺乳动物细胞中主要通过以不完全互补的形式结合到目的基因的3’非编码区(3’UTR),来抑制靶基因的表达,是一种重要的蛋白表达调控方式,在肿瘤发生过程中起到十分重要的作用,研究发现,部分miRNAs在胶质瘤中表达异常。我们结合生物信息学和生物学实验寻找可能作用于Ubc9的miRNA:首先利用TargetScan等对Ubc9的3’端非编码区可能结合的miRNA进行了生物信息学分析,并用Real-time PCR检测了部分niRNAs在神经胶质瘤组织和细胞系中的表达。依据Ubc9蛋白表达水平在胶质瘤中有升高的趋势,故选择在胶质瘤中表达降低的miRNA,实验结果表明miR-214和miR-203在神经胶质瘤病理组织中低表达。后续的蛋白水平分析和荧光素酶活性分析结果进一步确定miRNA-214是Ubc9表达的调控因子。为进一步验证miR-214对Ubc9的表达调控,将miR-214的成熟序列转染T98G细胞和A172细胞,MTT实验检测到T98G和A172细胞增殖减缓,随后用TUNEL显色检测了细胞的凋亡情况,发现miR-214过表达后细胞发生凋亡的比例与对照组相比明显升高,且有统计学差异。Western blot结果表明在两种细胞系中miR-214的过表达下调了细胞内源性Ubc9的表达。将针对Ubc9的siRNA序列分别转染T98G和A172细胞,采用相同的实验方法检测细胞的变化,结果表明:在两种细胞系中,Ubc9的敲低会引起细胞增殖减缓,而TUNEL显色实验亦发现Ubc9敲低后细胞发生凋亡的比例明显升高,说明Ubc9的表达变化影响了细胞凋亡相关的通路。siRNA引起的细胞学效应与miR-214过表达导致的类似,进一步说明miR-214影响到神经胶质瘤中Ubc9的表达。Western blot检测发现转染针对Ubc9的siRNA序列或miR-214成熟序列引起的Ubc9表达水平降低均伴随着细胞SUMO化程度的减弱,表明在神经胶质瘤中miR-214通过对Ubc9的表达调控影响了细胞的SUMO化状态。从上述实验可以看出,miR-214表达下调导致Ubc9蛋白水平的表达上调,从而影响神经胶质瘤细胞SUMO修饰异常,促使胶质瘤细胞凋亡失控和异常增生,引起肿瘤的发生。