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兔出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease virus，RHDV)所致的兔的一种急性、高度传染性、高度致死性的疾病，以全身实质器官水肿、淤血及出血性变化为主要特征。根据RHDV的形态学、生物化学和分子生物学特性，国际病毒分类委员会最近将其归类于嵌杯样病毒科兔病毒属。该病毒为单股正义RNA病毒，基因组由7437个核苷酸组成，拥有两个开放阅读框架，分别编码多个蛋白，其中衣壳蛋白是RHDV的唯一结构蛋白，称为VP60，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。目前广泛使用的RHDV疫苗为组织灭活苗，虽然其长期以来一直具有良好的免疫效果，但具有其自身所不可避免的种种缺点。由于兔出血症病毒在体外组织细胞的培养方法尚未建立，所以，近年来，人们对RHDV疫苗的研究便主要着眼于基因工程苗的研制，其既能起到免疫预防作用，又能很好地解决组织灭活苗所带来的生物安全性问题。基于此，本研究在对RHDV不同分离株的VP60基因同源性进行广泛比较的基础之上，分别以大肠杆菌、昆虫细胞和毕赤酵母表达系统表达了中国株RHDV VP60基因，研究其抗原性和免疫原性，以期探索一条制备RHDV新型疫苗的途径。 本研究首先应用RT—PCR技术，从兔出血症病毒中国分离株WX84株中成功扩增出预期大小为1.7kb的衣壳蛋白基因特异性条带，将扩增产物提纯后克隆入pGEM-T载体，经转化、筛选及酶切鉴定后，获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆pGEM-T-VP60，序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1740bp，共编码580个氨基酸，该序列已被Genebank收录，登录号为AF402614，该序列为11扬州大学博士论文Genebank收录的第一株RHDV中国分离株完整VP6O序列，也是国内外最早克隆测序的RHDV中国分离株VP6O序列，并且该毒株还是世界上最早分离的RHDV毒株。与其它国家报道的多株RHDV序列进行比较发现，其相互间同源性高达98 .2%~99.0%，其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%一99.1%，并且都没有碱基的插入和缺失，表明VP60是一个很保守的片段。该核酸序列与欧洲野兔综合征病毒(European br0Wn hare syndrome virus，EBHSV)和无致病性的兔嵌杯样病毒(Rabbit ealieivirus，RCV:)的核酸同源性则分别只有68.8%~70.5%和85.8%~86.5%之间，氨基酸同源性分别居74.5%~75.0%和90.6%~91.9%之间。 应用亚克隆技术将编码兔出血症病毒(RHDV)WX84株衣壳蛋白的VP60基因物按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX一6P一1中谷胧甘肤转移酶(GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1 .Olnmol/L IPTG浓度和37℃的条件下诱导，GST一VP60基因融合蛋白获了高效表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的20.52%。经聚丙烯酞胺凝胶电泳和Western一blot试验证实所表达的融合蛋白产物分子量与预期的87K Dal相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠，所得抗血清应用间接El.工SA检测，与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明，大肠杆菌中表达的RHDV VP6O融合蛋白保留着天然衣壳蛋白的部分抗原性。但该表达产物与RHDV的天然高免血清反应强度较弱，提示着该表达产物在抗原性上与天然RHDV的Vp6O蛋白还存在着一定的差异，这可能与其融合有一个29Kd的谷胧甘肤(GST)有关。 为更好的研究重组VP印蛋白的的抗原性和免疫原性，利用亚克隆技术将RHDV的VP6O基因克隆入另一广泛使用的原核表达载体—PETS中进行表达研究。该载体仅融合有一个包括n个氨基酸的表达标签(T7*TAG)，并且该表达标签经研究发现对大多数动物的免疫原性都极弱。将重组质粒PET5a--VP6O转化入大肠杆菌BL21(DE3)株，在0.4nunol/L IPTG浓度和37oC的条件下诱导3小时，VP60蛋白获了高效表达，表达的目的蛋白在菌体总蛋白中含量超过17.14%。经聚丙烯酞胺凝胶电泳和Western一blot试验证实所表达的蛋白产物分子量与预期的62K Dal相符。并且，该重组蛋白在Western一blot中与兔抗RHDV高免血清呈强阳性反应，对vP60两种融合蛋白的比较结果表明，融合蛋白中前导多肤的大小确实对被表达蛋白诸如抗原性等的生物学活性具有较大地影响。 昆虫杆状病毒表达系统是一种良好的真核表达体系，以其忠实高效表达而广严维巍:兔出血症病毒中国株衣壳蛋白墓因的表达及其免疫原性初探111泛应用于外源基因的体外表达及结构与功能研究。本研究为了构建表达阳DV VP60蛋白的重组杆状病毒，以心了H对含有RHDV VP60基因的重组克隆载体PG即一T-VP60进行单酶切，经琼脂糖凝胶电泳后回收R圣IDV VP60基因片断，并与抢了H单酶切的杆状病毒转移载体PBLUEBAc4和PBLUEBACHISB连接，以氛化钙法转化大肠杆菌TOP10F’株，获得T重组转移载体pBLUEBAC4一即60和pBLUEBACHISZB一VP60。在脂质体转染试剂介导下，将重组杆状病毒转移载体曲LUEBAc4一vP60和pBLUEBACH工SZB一vP6O与线性化的野生型杆状病毒DNA共转染对数生长期的Sfg昆虫细胞，经过三轮蚀斑纯化后，获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUEBAC4一vP60和PBLUEBAcHISZB一VP60。提取重组杆状病毒DN