研究背景角膜病在我国致盲的主要原因中位居第二,角膜移植是目前临床上医治角膜盲唯一、有效的复明手段。眼球是一个独特的免疫器官：其自身具有免疫赦免及前房相关免疫偏离的免疫学特点,同时角膜组织中没有血管及淋巴管,因此,角膜移植手术的成功率较其它组织器官明显增高。尽管如此,角膜移植术后发生的免疫排斥反应依然是致使移植失败的最重要原因。研究认为,角膜移植免疫应答过程由多种类型免疫细胞、活化因子协同介导,同时受多种因素的影响。充分了解免疫排斥反应过程中各种免疫细胞和细胞因子的作用及其作用机制,有助于为将来角膜移植排斥反应的临床预防、诊断及治疗提供新的思路。近年来,许多新型细胞因子陆续被发现,并被证实在移植免疫反应中发挥重要作用。白细胞介素22(interleukin-22,IL-22)和白细胞介素33(interleukin-33,IL-33)分别属于近年来发现的白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素1(IL-1)家族新成员。IL-22通过与其受体复合物(IL-22R1-IL-10R2)结合,激活细胞内酪氨酸激酶Jak1、Tyk2、信号转导与转录活化因子3(STAT3)信号转导途径及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路(MEK-ERK-RSK、JNK/SAPK和p38激酶),广泛参与调控机体多种疾病(如慢性炎症、自身免疫性疾病、肿瘤和移植免疫反应等)的免疫应答过程。IL-33与其跨模型ST2受体(ST2L)相互作用,可诱导MyD88、IRAK1和IRAK4、TRAF6等分子聚集,进一步激活胞内核因子-κB (NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)(包括ERK1、ERK2、p38及JNK1)信号通路,参与机体免疫应答调节。除此之外,还可上调树突状细胞(DCs)表面MHCⅡ分子及共刺激分子CD86的表达,增强DCs的抗原提呈功能。基于白细胞介素-22(IL-22)和白细胞介素-33(IL-33)这两类新型细胞因子在固有免疫及适应性免疫应答过程中具有重要免疫学效应,目前它们在机体多种疾病(尤其是自身免疫性疾病、过敏性疾病、感染及心血管疾病)中的调节作用已得到广泛研究,在器官移植免疫方面也引起了人们的重视。至今为止,国内外关于IL-22、IL-33在角膜移植免疫排斥反应中的作用还没有相关的研究报告。为此,本课题通过建立SD-Wistar大鼠间的穿透性角膜移植模型,以白细胞介素-22(IL-22)和白细胞介素-33(IL-33)这两种新型细胞因子为研究对象,观察角膜移植术后不同时间点植片中IL-22、IL-33的表达变化,初步探讨其在角膜移植术后免疫反应中的潜在生物学效应及其作用机制,为将来更有效地临床预防和治疗角膜移植免疫排斥反应提供新的策略。第一部分 IL-22在大鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用探讨目的探讨IL-22在大鼠角膜组织中的表达及其在角膜移植术后免疫排斥反应中的作用。方法1.穿透性角膜移植模型的建立与实验分组：分别取24只SD大鼠作为移植供体,72只Wistar大鼠作为受体,行同种异体间角膜穿透性移植术。实验将72只受体随机分为三组：自体角膜移植组(B)、角膜移植排斥组(C)和角膜移植后典必殊治疗组(D),另取4只Wistar鼠共8只眼作正常对照(即正常对照组A)。D组术后每日滴典必殊眼液,每日2次,每次1滴,共用2周。2.角膜植片的临床观察及评分标准：角膜移植术后14天内,每日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片的混浊程度、水肿程度及新生血管生长情况；14天后,隔日观察一次,观察期为30天。参照Larkin等的评分方法,对角膜混浊程度、水肿程度及新生血管情况进行评估,角膜混浊程度分为0-4级(0：植片完全透明；1：植片轻度混浊；2：植片中度混浊,裂隙灯下虹膜血管可见；3：虹膜血管窥不清,仅可见瞳孔轮廓；4：植片完全混浊,瞳孔轮廓窥不清)；角膜水肿程度分为0-2级(0：植片未发生水肿；1：植片出现中度水肿；2：植片明显水肿,伴基质层显著增厚)；角膜新生血管分为0-4级(0：植片无新生血管形成；1：新生血管长至植片任一象限半径的25%处；2：新生血管长至植片任一象限半径的50%处；3：新生血管长至植片任一象限半径的75%处；4：新生血管长至植片中央区域)。上述3项指标的评分总和为当日排斥反应指数(RI),如三项评分总和(m)≥5分或者植片混浊度一项达到3分,则认为角膜植片发生免疫排斥。3.组织病理学检测：各组分别于术后第5、14天随机抽取3只大鼠眼球,标本取出后立即行4%多聚甲醛固定,固定完成后再经不同浓度乙醇梯度脱水、石蜡包埋,然后制备成5μm厚的连续切片,采用苏木素-伊红(HE)染色,中性树胶封片,光学显微镜下观察并拍照。4.实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测：各组分别于角膜移植术后第5、14天随机取5只角膜,并立即置于-80。冰箱保存。按取材时间点分别进行RNA提取、逆转录及PCR扩增反应,观察角膜组织中IL-22mRNA和AhRmRNA的表达情况。结果1.各组角膜植片的临床观察：角膜移植术后前3天,各组角膜植片均出现轻度水肿、混浊,B、C组角膜缘处出现新生血管,D组角膜缘未见新生血管。B组和D组角膜植片水肿、混浊程度随时间延长逐步减轻,而C组植片则进行性加重直至彻底混浊,且伴随植片增厚。另外,B组和C组角膜新生血管由植床向植片方向逐渐延伸,于术后第14天可达到植片中央,而D组新生血管仅局限于角膜缘。2.各组角膜植片的存活时间(MST)：C组角膜植片平均存活(10.13+0.44)d,D组平均存活(18.00±0.66)d,二者间具有显著性差异(P<0.01)。3.A组大鼠角膜上皮层由5-6层细胞所构成,基质层胶原纤维排列规则,无水肿及炎性细胞浸润。C组角膜植片显著水肿伴基质层增厚,基质层中胶原纤维结构紊乱,炎性细胞弥漫性浸润,并可见新生血管管腔,术后第14d较5d更加明显。而B组和D组角膜结构基本正常,基质层仅有少许炎性细胞浸润。4.各组IL-22和AhRmRNA在不同时间点的表达：A、B组角膜植片内均可见IL-22mRNA表达,C组IL-22mRNA的表达水平显著增加,而D组角膜IL-22mRNA的表达较C组明显降低(P<0.05)；另外,AhRmRNA有类似表达趋势。结论IL-22可能参与了大鼠角膜移植免疫排斥反应的发生过程,而AhR参与IL-22的表达调控过程。第二部分IL-33在大鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用目的探讨IL-33在大鼠角膜组织中的表达以及对角膜移植术后免疫排斥反应的影响。方法1.穿透性角膜移植模型的建立与实验分组：取4只Wistar鼠(8只眼)作为正常对照组(A),24只Wistar鼠作为自体角膜移植组(B),另取24只SD鼠为供体和48只Wistar鼠为受体进行同种异体间穿透性角膜移植(C、D),D组术后每日滴典必殊眼液(2次/d),共2周。2.角膜植片的临床观察及评分标准：角膜移植术后14天内,每日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片的混浊程度、水肿程度及新生血管生长情况；14天后,隔日观察一次,观察期为30天。参照Larkin等的评分方法,对角膜混浊程度、水肿程度及新生血管情况进行评分,角膜混浊程度分为0-4级(0：植片完全透明；1：植片轻度混浊;2：植片中度混浊,裂隙灯下虹膜血管可见；3：虹膜血管窥不清,仅可见瞳孔轮廓；4：植片完全混浊,瞳孔轮廓窥不清)；角膜水肿程度分为0-2级(0：植片未发生水肿；1：植片出现中度水肿；2：植片明显水肿,伴基质层显著增厚)；角膜新生血管分为0-4级(0：植片无新生血管形成;1：新生血管长至植片任一象限半径的25%处；2：新生血管长至植片任一象限半径的50%处；3：新生血管长至植片任一象限半径的75%处；4：新生血管长至植片中央区域)。上述3项指标的评分总和为当日排斥反应指数(RI),如三项总和(RI)≧5分或者植片混浊度一项达到3分,则认为角膜植片发生免疫排斥。3.组织病理学观察及免疫组织化学检测：各组分别于角膜移植术后第5、14天随机取3只大鼠眼球行4%多聚甲醛固定,经梯度酒精脱水、石蜡包埋,然后制备成5μm厚的连续切片,采用苏木素-伊红(HE)染色观察角膜组织病理学改变,并行免疫组织化学检测角膜组织中ST2蛋白的表达水平,光学显微镜下观察并拍照。4.实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测：各组分别于术后第5、14天随机取5只角膜,并立即置于-80°冰箱保存。按取材时间点分别进行RNA提取、逆转录及PCR扩增反应,检测角膜组织中IL-33mRNA、ST2mRNA的表达水平。结果1.各组角膜植片的临床观察：角膜移植术后前3天,各组角膜植片均出现轻度水肿、混浊,B、C组角膜缘处出现新生血管,D组角膜缘未见新生血管。B组和D组角膜植片水肿、混浊程度随时间延长逐步减轻,而C组植片则进行性加重直至彻底混浊,且伴随植片增厚。另外,B组和C组角膜新生血管由植床向植片方向逐渐延伸,于术后第14天可达到植片中央,而D组新生血管仅局限于角膜缘。2.各组角膜植片的存活时间(MST):C组角膜植片平均存活(10.13+0.44)d,D组平均存活(18.00±0.66)d,经Log-rank检验,二者间具有显著性差异(x2=16.442,P=0.000)。3.A组大鼠角膜上皮层由5～6层细胞所构成,基质层胶原纤维排列有序,无水肿及炎性细胞浸润。C组角膜植片显著水肿伴基质层增厚,基质层中胶原纤维结构紊乱,炎性细胞弥漫性浸润,并可见新生血管管腔,术后第14d较5d更加明显。而B组和D组角膜结构基本正常,基质层仅有少许炎性细胞浸润。4.术后不同时间点各组IL-33mRNA、ST2mRNA及ST2蛋白的表达：IL-33mRNA、ST2mRNA及ST2蛋白在A组和B组角膜组织中均可见表达,在C组中表达水平显著增加,而在D组中表达明显减少(P<0.05)。结论IL-33可能参与了大鼠角膜移植术后免疫排斥反应。