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宿主与病原的互作关系是目前生物学研究的焦点之一。在揭示包括人类病原微生物侵染宿主的过程及其机制中,哺乳动物宿主模型仍然是最主要的研究手段。但哺乳动物宿主模型也具有花费高、不易操作、存在众多复杂影响因素等局限性。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为一种重要的模式生物,其背景资料丰富,基因组已经完全被测序,并与人类疾病相关的基因有高度的同源性,再加上价格廉价、且容易操作和观察等技术优势,使之成为研究病原微生物致病机制的新模型。目前以秀丽隐杆线虫作为侵染宿主已广泛应用于苏云金芽孢杆菌及人类致病菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等多种病原菌的研究中,阐明病原菌的毒力因子种类、与宿主的相互作用过程、以及致病机制等多个方面。 解淀粉酶芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42是一种能够产生多种次生代谢产物,在促植物生长及抑植物病原菌方面有显著活性的菌株。前人的研究和我们前期的生测实验均提示,该菌株具有较强的杀线虫活性,但目前其侵染线虫的机制还不清楚。在本研究中,借助解淀粉芽孢杆菌FZB42菌株全基因组测序完成并已成功构建其全基因组的随机突变文库的有利背景,采用秀丽隐杆线虫宿主模型,通过筛选解淀粉芽孢杆菌FZB42随机突变文库中侵染能力降低的突变子,然后再通过反向PCR技术、巢式PCR技术、抑制剂拮抗、基因敲除、回复突变等功能实验,证明与分选酶作用相关的yhcT基因、编码假想蛋白的neK基因以及参与编码大环内酯抗生素的mlnD基因参与解淀粉芽孢杆菌FZB42侵染线虫过程。该研究进一步丰富了食线虫细菌侵染线虫的分子机制。 本文主要结果为: 1、B.amyloliquefaciens FZB42中与侵染线虫相关新的功能基因的鉴定。通过液体杀线虫生测实验,从解淀粉芽孢杆菌FZB42的随机突变文库中对400多个突变子进行筛选,最终挑出了与野生菌株FZB42相比杀线虫活性显著下降的2个突变子:F1和F2。经过反向PCR技术和巢式PCR技术鉴定出三个候选功能基因:mlnD(RBAM_014360)、yhcT(RBAM_009470)和yneK(RBAM_017760)。 2、分选酶相关基因yhcT在侵染线虫过程中的功能验证。yhcT(RBAM_009497)基因与yhcS(RBAM_009460)基因共用同一启动子,在FZB42中yhcS基因编码保守的假想蛋白,yhcS基因经同源比对证实是编码分选酶的基因。因此我们推测yhcT基因具有与分选酶作用相关的杀线虫功能。利用分选酶的抑制剂盐酸黄连素对FZB42进行处理,并在F1突变子中构建了yhcT基因的回复菌株F1-yhcT,通过杀线虫生测实验,证实了分选酶作用相关基因yhcT在解淀粉芽孢杆菌FZB42侵染线虫过程中起重要作用。 3、yneK基因在侵染线虫过程中的功能验证。yneK基因(RBAM_017760)编码一个假想蛋白,为了验证该基因的功能,我们在FZB42中构建了yneK基因的定点敲除菌株△yneK,并对转座子插入突变株F1、yneK基因敲除菌株△yneK和野生型菌FZB42做了液体杀线虫生测实验,证明了yneK基因在解淀粉芽孢杆菌FZB42侵染线虫的过程中有作用。 4、大环内酯抗生素在侵染线虫过程中的功能验证。mlnD基因属于PKS(聚酮合成途径)家族typeI中的pks2基因簇中的一员,mlnD基因功能的缺失会导致大环内酯类抗生素不能正常合成。为了验证mlnD基因的功能,我们构建了mlnD基因的敲除菌株△mlnD,并对FZB42、F2和△mlnD进行了杀线虫生测验证,结果证实了参与编码大环内酯抗生素的mlnD基因在FZB42侵染线虫的过程中起重要作用。 本论文的创新主要体现为: 目前国内外关于解淀粉芽孢杆菌FZB42杀线虫相关基因的报道还很缺乏。本研究揭示了解淀粉芽孢杆菌FZB42中分选酶相关的yhcT基因、参与编码大环内酯抗生素的mlnD基因及yneK基因在解淀粉芽孢杆菌FZB42侵染线虫的过程具有重要作用。