目的：股骨头缺血坏死（Osteonecrosis of femoral head，ONFH）是骨科临床的常见病、多发病，治疗困难、致残率高，是目前医学领域尚未攻克的三大难题之一。原发性股骨头缺血坏死与患者基因突变有关，继发性股骨头缺血坏死又分为非创伤性和创伤性股骨头缺血坏死。创伤性股骨头缺血坏死的发病原因较明确，为外伤导致病人股骨头血管血流的中断，从而引起骨细胞缺血并坏死。而非创伤性股骨头坏死临床上多见于长期大剂量使用激素和酗酒所导致[1]，其发病机制尚不清楚，近年来，随着皮质类固醇激素在临床上的广泛使用，股骨头坏死病例也大幅增加。对于股骨头缺血坏死的病理学研究尤为迫切，确切的发病机理将为寻找理想的治疗方案奠定基础。本研究项目旨在对长期大剂量使用激素的股骨头缺血坏死病人，从大样本的激素性股骨头坏死（SONFH）病例中提取血清蛋白，按照ARCO分期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期）进行分类，对血清蛋白进行全面系统的蛋白组学分析。此研究将弥补既往研究中病例少、忽略股骨头坏死原因及病理分期的不足。通过以上蛋白组学的分析，筛得候选血清蛋白标志物，根据这些候选蛋白分子的差异表达进一步深入研究长期大剂量使用激素引起股骨头坏死的发病机理。研究这些候选蛋白表达与股骨头坏死分期的相关性，对股骨头坏死预后进行预测并作为评估股骨头坏死保髋治疗疗效的生化指标。根据这些候选蛋白与股骨头缺血坏死发病机理的相关性为今后寻找高效药物治疗确定方向，同时筛选出特异的生物标志物，作为快速、特异的股骨头坏死临床早期诊断方法。方法：1、提取人血清总蛋白：根据纳入标准和排除标准，各抽取正常人群及股骨头坏死患者3mL静脉血，离心、提纯后收集血清，置于-80℃冰箱备用。2、血清蛋白样本处理：利用TCA/丙酮沉淀法处理蛋白样本，试剂盒去除高丰度的白蛋白及球蛋白，得到最终样本。3、双向凝胶电泳（2-DE）：对所制得胶条先后进行等点聚焦电泳（IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），取出凝胶条，进行考马斯亮蓝染色。4、图像分析：使用扫描仪进行扫描成像，考染图像分析使用PDQuest8.0软件(Bio-Rad)进行分析。通过对分析胶的对比分析，可以找出比较组中表达呈现差异的蛋白点，这些差异蛋白点在考染凝胶中相对应的蛋白斑点将作为质谱分析的对象。5、飞行时间质谱分析（MALDI-TOF MS）：对目标蛋白点进行胰蛋白酶酶切，提取多肽混合物。取0.3ul肽段提取液，与相等体积α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和0.1TFA/50乙腈溶液混合后点于质谱仪的样品板上。按照说明进行操作。6、蛋白质数据库查询：使用Mascot检索软件检索NCBInr数据库，输出结果报告。7、差异蛋白Western-Blot分析：选取纤维蛋白原γ链(FGG)和纤维蛋白原β链(FGB)，进行Western-Blot(蛋白免疫印迹），测量蛋白质浓度含量，与2-DE试验结果相验证。结果：通过2-DE分离出600±20个蛋白质斑点，得到明显差异蛋白点73个，挖取表达差异达2倍以上的差异巨大蛋白质点11个，使用MALDI-TOF/TOF质谱仪分析鉴定这些差异蛋白点，得到蛋白质4种，它们是纤维蛋白原γ链(FGG)、纤维蛋白原β链(FGB)、ATP合成酶、载脂蛋白AI(APOAI)。其中坏死组载脂蛋白AI(APOAI)表达下调，其余3种蛋白表达均上调。通过多数据库查询，这些蛋白参与分别涉及参与形成细胞骨架、能量代谢、氧化还原及信号转导等方面的功能，有可能成为潜在的蛋白标志物。选取纤维蛋白原γ链(FGG)和纤维蛋白原β链(FGB)做Western-Blot，结果与2-DE结果相符。结论：1．从SONFH患者血清中分离股骨头坏死相关蛋白质，有助于阐明激素引起的股骨头坏死的病理生理学机制，且取材方便，蛋白样本处理容易，创伤小，患者容易接受。2．使用双向凝胶电泳(2-DE)能够有效分离血清蛋白质组，并获得激素性股骨头坏死（SONFH）的差异蛋白质表达图谱。3．使用MALDI-TOF/TOF质谱仪分析鉴定这些差异蛋白点，得到蛋白质4种，进行生物学信息学分析，这些蛋白质可能与SONFH的病理机制相关，为临床诊断中生物标志物的筛查、SONFH分子靶向治疗提供了理论依据。4．通过Western-Blot对纤维蛋白原γ链(FGG)和纤维蛋白原β链(FGB)表达量进行验证，结果和2-DE结果一致，证明了以上研究的准确性和可靠性。