1.研究背景与目的 鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)是我国南方各省及东南亚常见的一种恶性肿瘤，其中广东省是全世界最高发的地区，世界人口标化发病率高达男30/10万，女13/10万。目前的研究结果公认遗传因素、环境因素、EB病毒(Epstein-BarrVirus，EBV)感染及其三者之间的相互作用是鼻咽癌发生的重要病因学模型。鼻咽癌具有显著的地区差异、家族聚集现象，移民流行病学研究的证据和复合分离分析研究结果均提示遗传因素在鼻咽癌的发生发展中起着重要作用。EB病毒感染又是鼻咽癌的重要病因，环境致癌因素则伴随着整个发生发展过程。立足于遗传—环境相互作用，鼻咽癌相关基因的研究涉及到了人类白细胞抗原(HumanLeukocyteAntigen，HLA)分子、谷胱甘肽转移酶M1(GlutathioneS-TransferaseM1，GSTM1)、细胞色素P4502E1酶(CytochromeP4502E1enzyme，CYP2E1)、多聚免疫球蛋白受体(Polyimmunoglobulinreceptor，PIGR)、T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)、DNA修复基因等，但始终没有发现一个类似于乳腺癌易感基因BRCA1的主效基因在鼻咽癌的发病过程中起重要作用。本研究小组对23个持粤语方言的鼻咽癌高发家系进行连锁分析将鼻咽癌的易感基因定位于4p15.1-4q12区域。进一步对两个高发家系的单体型分析，将易感区域缩小至4p11-4p14区域。核心家系的TDT分析，结果提示在4号染色体微卫星标记D4S350处连锁不平衡最显著，此处极可能存在鼻咽癌易感基因。此后本研究小组一直致力于采用候选克隆方法在此区域内筛选鼻咽癌潜在致病基因。 最近我们研究了部分免疫反应相关基因，特别着重于Toll样受体(Tolllikereceptor，TLR)家族成员。Toll样受体家族的三个基因TLR1、TLR6和TLR10恰好位于4p11-4p14区内。Toll首先是在果蝇胚胎时期背腹极向分化中发现的关键蛋白。后来发现它在果蝇抗真菌感染的固有免疫中起到了关键作用。人类Toll样受体家族属于白介素1受体超家族，与白介素1受体超家族成员胞内部分同源。病原分子是它们识别的内外源性配体。TLRs将识别信号传递到核指导有关细胞因子合成，从而有机连接了固有免疫和适应性免疫。有研究表明TLRs家族识别内源性病毒核酸，但TLRs受体与EB病毒感染之间关系的研究尚无报道。 本研究的目的就是基于鼻咽癌易感基因定位的结果，采用位置候选克隆策略和功能候选策略在4p11-4p14区域内，针对Toll样受体家族的三个基因TLR1、TLR6和TLR10，用PCR—测序的方法，筛查是否存在与高发区鼻咽癌患者相关联的序列变异，为鼻咽癌易感基因功能研究寻找到合适的遗传学候选者。希望找到与鼻咽癌相关联的SNP，或SNP单体型。本研究的创新之处在于首次在鼻咽癌患者中检测了TLR1、TLR6和TLR10基因序列变异，探讨了三个基因单核苷酸多态性与鼻咽癌易感性的关系以及三个基因单核苷酸多态性与EB病毒感染的关联性。 2.研究方法 本研究在既往采用24份散发鼻咽癌样本筛选到的TLR6-TLR1-TRL10区域内的36个变异的基础上，运用标签SNP筛选软件，筛选出13个代表此区域内95％以上单体型的标签SNP，加上一个TLR1基因启动子区的TC插入变异。在480个持广州方言的散发鼻咽癌患者和578个健康广府人中，分型确认这些位点是否与鼻咽癌发病有关。在研究中，PCR扩增采用多重PCR和单一PCR相结合的方法，大大节约了DNA模板的用量。引物设计用在线PRIMER3.0软件。所有PCR反应均在PE9700PCR扩增仪上进行，产物用酶解纯化于ABI377测序仪上测序，SNP分型采用了直接测序法。序列读解采用Phred/Phrap/consed软件包、DNAStar/Seqman和Chromas软件。 3.结果 共筛查了TLR1上5个变异，TLR6上2个变异，TLR10上7个变异，除TLR1上启动子区一个双碱基插入外，其它均为cSNP，其中改变氨基酸的cSNP有9个。单个位点的关联分析中，在比较TLR1启动子区TC碱基插入(-5984TCinsertion)纯合子(P=0.05，OR=0.452，CI0.204-1.001)、TLR1外显子上的错义突变Ser44Pro(P=0.048，OR=0.576，CI0.333-0.995)和Asn248Ser(P=0.05，OR=0.589，CI0.346-1.000)在病例组和对照组中的频率分布时，均获得一个边缘性P值。TLR6Val327Met在病例组和对照组中的分布虽然没有显著差异，在年龄分层分析中发现这一变异对于低年龄人群来说可能是一个危险因素(P=0.042，OR=1.54，CI1.097-2.163)；性别分层分析发现，男性中TLR6Ile120Thr(P=0.004，OR=1.725，CI1.185-2.513)和TLR6Val327Met(P=0.012，OR=1.667，CI1.114-2.496)在病例组和对照组的频率有显著差异。在对照组中分析了TLR变异与EBV感染的关系，发现TLR10Gly381Asp的基因型频率分布在EBV阳性组和阴性组有显著差异(P=0.004，OR=0.564，CI0.348-0.913)，比较TLR10另一同义突变TLR10G1031T的基因型频率分布在EBV阳性组和阴性组的差异，获得一个边缘性P值(P=0.048，OR=1.637，CI1.000-2.681)。 单体型分析发现这些SNP共构成两个haplotypeblock，TLR10基因的SNP组成1个Haplotypeblock，TLR1基因和TLR6基因的SNP组成另一个Haplotypeblock。经Haplo.stats分析，与TLR10最常见的单体型“GAGTGAA”比较，携带单体型“GCGTGGC”人群罹患鼻咽癌的危险性显著提高(P=0.00462)，经过调整年龄、性别和VCA-IgA抗体滴度，这种相关性更加显著(P=0.00066)。Globalscoretest和Haplo.glm分析均得到与Haplo.stats分析一致的结果。“GCGTGGC”在病例组和对照组中的频率有显著性差异(P=0.00242，OR=2.66，CI1.34-3.82)。 与TLR1和TLR6最常见的单体型“GAATGT”比较，携带单体型“AAGTGC”人群罹患鼻咽癌的危险性显著提高(P=0.017)，经过调整年龄、性别和VCA-IgA抗体滴度，这种相关性更加显著(P=0.00402，OR=4.124，CI1.567-10.858)。 4.讨论 本研究采用位置候选克隆策略和功能候选策略，在易感基因候选区域4p11-4p14对TLR1、TLR6、TLR1三个基因进行了序列分析，对13个标签SNP和1个启动子区的双碱基插入位点进行患者和正常人群中的分型。发现TLR1的3个位点和TLR6的一个位点与鼻咽癌发病存在边缘关联性。对这几个位点的评价需慎重。1)提示这些SNP所在基因可做为鼻咽癌候易感基因或微效基因进行下一步研究；2)这些SNP做为遗传标记指示鼻咽癌易感基因在其附近；3)不排除这些SNP与鼻咽癌的假关联，原因可能是抽样误差，样本量太小等等。 在单体型分析中发现TLR10上一个人群携带率为11.4％的单体型“GCGTGGC”与鼻咽癌发病相关(P=0.00462)，这种相关性在调整年龄、性别和EBV抗体滴度后更加显著(P=0.00066)，这一结果又得到Globalscoretest和Haplo.glm分析的验证。特异性的P值和反复验证的结果与TLR10变异与EBV感染关联性的结果，提示TLR10的这一单体型是一个鼻咽癌的潜在危险因素，潜在的遗传学改变和EBV感染可能共同作用于鼻咽癌的发生发展。 TLR6和TLR1上一个人群携带率为1.9％的单体型“AAGTGC”也与鼻咽癌发病相关，经过调整年龄、性别和VCA-IgA抗体滴度，这种相关性更加显著(P=0.00402，OR=4.124，CI1.567-10.858)。由于这一单体型的人群携带率相对较低，这一关联性还有待于在将来的工作中进一步验证。 5.结论 TLR10的遗传学改变是一个鼻咽癌的潜在危险因素，潜在的遗传学改变和EBV感染可能共同作用于鼻咽癌的发生发展。