论文部分内容阅读
目的:探究转录因子c-jun对糖基转移酶β3Gn T8的转录调控作用及研究β3Gn T8与c-jun在结肠癌侵袭迁移中的分子机制。方法:(1)培养三种人结肠癌细胞株SW620、SW480、Lo Vo,并通过Western-blot检测这三种结肠癌细胞中c-jun和β3Gn T8蛋白的表达水平及通过Transwell法检测c-jun和β3Gn T8高、低表达的细胞在24h时的侵袭迁移能力;(2)Ch IP技术检测c-jun与β3Gn T8基因启动子区的结合作用;(3)将c-jun过表达质粒、c-jun sh RNA干扰载体及其空载体通过lip2000脂质体介导的方法分别转染至c-jun和β3Gn T8蛋白的表达低的SW480细胞和表达程度高的Lo Vo细胞中;(4)荧光显微镜观测转染带有GFP标记载体的细胞株,Real time-PCR及Western-blot检测转染后SW480中c-jun上调后和Lo Vo细胞中c-jun下调后β3Gn T8、CD147以及相关分子的m RNA和蛋白的表达变化;(5)流式细胞术检测c-jun对β3Gn T8参与合成的细胞表面多聚乳糖胺糖链的表达水平;(6)Transwell和细胞划痕修复实验检测SW480中c-jun上调后和Lo Vo中c-jun下调后,对细胞侵袭和迁移能力的影响;(7)筛选获得β3Gn T8和β3Gn T2基因的有效si RNA片段;(8)将c-jun过表达载体与筛选获得的β3Gn T8、β3Gn T2基因的最有效干扰片段通过脂质体介导共转染结肠癌SW480细胞,RT-PCR检测β3Gn T8 m RNA的表达变化,并通过Transwell检测各组细胞的迁移能力。结果:(1)Western-blot检测三株结肠癌细胞株中c-jun和β3Gn T8的蛋白表达水平由低到高依次为SW480→SW620→Lo Vo,Transwell结果显示24h时SW480细胞转移细胞数极少,而Lo Vo转移细胞数很多;(2)Ch IP实验结果显示c-jun与β3Gn T8基因启动子区有相互结合;(3)通过荧光显微镜观察、Real time-PCR及Western-blot检测发现SW480中c-jun上调后,与空白对照组相比,β3Gn T8、HG-CD147及MMPs的m RNA和蛋白表达水平均升高;Lo Vo细胞中c-jun下调后,与空白对照组相比,β3Gn T8、HG-CD147及MMPs的m RNA和蛋白表达水平均下降;(4)流式细胞术实验结果显示,SW480中c-jun上调后,与空白对照组相比,细胞表面多聚乳糖胺链含量增加;Lo Vo细胞中c-jun下调后,与空白对照组相比,细胞表面多聚乳糖胺链含量降低;(5)细胞划痕损伤修复实验显示SW480中c-jun上调后,与空白对照组相比,损伤程度变小,提示细胞迁移能力增强;而Lo Vo细胞中c-jun下调后,与空白对照组相比,损伤程度变大,提示细胞迁移能力降低;(6)Transwell小室检测发现SW480中c-jun上调后,与空白对照组相比,穿膜细胞数明显增多,提示细胞侵袭和迁移能力增强;而Lo Vo细胞中c-jun下调后,与空白对照组相比,穿膜细胞数明显降低,提示细胞侵袭和迁移能力降低。(7)Real time-PCR筛选获得siβ3Gn T8-1754和siβ3Gn T2-1336两个最有效干扰片段,与c-jun过表达载体共转染SW480细胞后,RT-PCR检测结果显示,与单独转染siβ3Gn T8-1754和siβ3Gn T2-1336组相比,共转染组β3Gn T8 m RNA的表达升高,且高于未处理组;并用Transwell检测发现共转染组穿膜细胞数较c-jun过表达组明显减少,较单独转染siβ3Gn T8-1754和siβ3Gn T2-1336组升高。结论:(1)三株结肠癌细胞株中c-jun和β3Gn T8的蛋白表达水平由低到高依次为SW480→SW620→Lo Vo。(2)转录因子c-jun可能通过调节糖基转移酶β3Gn T8的表达来影响靶糖蛋白CD147的糖基化修饰水平进而参与细胞的转移进程。