目的和背景血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)存在于血管中膜,正常情况下能够合成分泌胶原蛋白并通过轻度收缩以维持血管壁的张力。研究表明VSMCs的异常增殖和迁移在高血压、动脉粥样硬化及经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)术后血管内再狭窄等的病理过程中起着重要作用。新近针对干细胞移植治疗的研究发现,间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)的移植有一定的促进损伤动脉内皮修复和抑制新生内膜增生的作用,但对抑制平滑肌增殖无直接作用。因此,如何通过相关基因修饰或改造MSCs,使之发挥最大效应,是下一步的研究需要解决的主要问题。有研究显示,降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-related Peptide,CGRP)与受体结合,在体内外均有抑制VSMCs增殖的作用,并逆转动脉重塑。VSMCs中己被证实有大量的CGRP受体表达,但CGRP并不能单独与受体结合,它需要受体活性修饰蛋白(Receptor Activity Modifying Proteins,RAMPs)的介导才能发挥作用,RAMP1是RAMPs家族中的一种,在VSMCs中检测到RAMP1受体的表达。本课题组前期实验研究显示：RAMP1修饰的MSCs能够抑制球囊损伤后中膜VSMCs增殖,促进损伤血管快速内皮化,减轻损伤血管后炎症细胞因子的表达,抑制内膜增生,从而减轻血管成形术后的再狭窄,但具体作用环节及机制尚不明确。我们推测上述结果可能与RAMP1抑制VSMCs增殖有关,而此抑制作用最终可能是RAMP1通过对CGRP的调控而实现的。为了验证上述推测,本研究拟通过构建高表达RAMP1的VSMCs和沉默RAMP1的VSMCs,观察RAMP1对VSMCs增殖的影响,并在此基础之上采用CGRP与RAMP1共干预的方法进一步探讨RAMP1对VSMCs勺作用机制是否是通过调节VSMCs对CGRP的敏感性而实现的,同时测定携带CGRP的慢病毒转染MSCs后,MSCs中CGRP的分泌量,之后通过与VSMCs共培养的方法观察高表达CGRP的MSCs是否能够稳定发挥CGRP的生物学效应,以期为本课题组下一步利用以CGRP为目的基因修饰的MSCs治疗血管成形术后再狭窄的体内研究,提供更为充分的前期实验准备。方法第一部分分别构建高表达RAMP1慢病毒载体(Lenti-GFP-RAMPl,简称RAMP1+/+),沉默RAMP1慢病毒载体(Lenti-GFP-shRAMPl,简称RAMP1+/+)及空病毒载体(Lenti-GFP,简称GFP+/+),分离获得大鼠胸主动脉VSMCs,细胞培养经同步化后,将上述已成功构建的慢病毒载体分别转染至VSMCs,实验分为四组：RAMP1+/+转染VSMCs组(简称RAMP1-/-组)、VSMCs转染VSMCs1-/-组(简称VSMCs组)、GFP+/+空病毒转染VSMCsGFP+/+组(简称VSMCs组)和ELISA对照组,每组又分为24h、48h、72h和96h共4个亚组。分别应用流式细胞技术测定慢病毒的转染率RAMP1法测定不同时间点各亚组RT-PCR的蛋白分泌量以确定最佳感染时间点；应用Western blot和VSMCs技术分别检测各组RAM11中VSMCs的基因和蛋白表达水平。此外,在慢病毒转染后6h加入AngⅡ诱导细胞增殖以模拟血管内Western blot增殖模型,应用MTT法、流式细胞技术和a-SM-actin(a-Smooth Muscle Antibody,a-SM-actin)技术检测各亚组细胞的增殖、凋亡、周期变化以及收缩蛋白(osteopontin,OPN)合成型蛋白骨桥蛋白VSMCs的表达变化；细胞划痕实验观察各组CGRP的迁移能力。第二部分RAMP1蛋白直接接触法：为了观察CGRP在VSMCs抑制CGRP增殖过程中的作用途径,以一定浓度的VSMCsRAMP1+/+、VSMCsRAMP1-/-蛋白干预上述VSMCS;及正常VSMCs实验分组如下：CGRP+VSMCs对照组、CGRP+VSMCsRAMP1+/+组、VSMCs组、CGRP组。分别应用MTT法和流式细胞术技术检测各组MSCs的增殖、凋亡及周期变化。细胞共培养法：为了进一步验证上述实验结果,同时观察高表达CGRP的慢病毒载体转染到CGRP后能否继续保持(Lenti-GFP-CGRP,原有的生物学效应。首先构建高表达CGRP+/+)的慢病毒载体MSCs,简称CGRP并转染MSCs(MSCsCGRP+/+)。使之成为高表达ELISA的MSCsCGRP+/+使用CGRP法检测上述MSCsCGRP+/+上清液中VSMCsRAMP1+/+、VSMCsRAMP1-/-蛋白分泌量。此后,应用VSMCs分别与上述MSCsCGRP+/++VSMCs RAMP1+/+及正常MSCsCGRP+/+共培养,实验分组如下：组、+VSMCsRAMPI-/-组、MSCsCGRP+/++VSMCs组、MSCs+VSMCs组、单纯VSMCs作为对照组。分别应用流式细胞术、Western blot技术检测各组VSMCs的凋亡、周期变化以及收缩蛋白a-SM-actin s合成型蛋白OPN的表达变化。结果第一部分慢病毒转染细胞72h后绿色荧光蛋白表达最强。当RAMP1+/+转染VSMCs后,细胞中RAMP基因水平及蛋白表达均较对照组明显增高(P<0.05)；而RAMP1+/+转染VSMCs后,细胞中RAMP1基因水平及蛋白表达较对照组明显减低(P<0.05)。同时,RAMP1+/+的转染能够抑制Ang Ⅱ诱导的VSMCs增殖,促进细胞早期凋亡,使细胞停留在静止期相对增多,收缩蛋白a-SM-actin表达增加,细胞迁移率明显降低,上述现象与对照组比较有显著差异性(P<0.05),表明高表达RAMP1明显抑制VSMCs增殖；相反,沉默RAMP1则能够促进AngⅡ诱导的VSMCs增殖,使细胞停留在静止期相对减少,同时合成型蛋白OPN表达增加,细胞迁移率增加,上述结果与对照组比较有显著差异性(P<0.05)；而GFP+/+转染组,即空病毒转染对VSMCs的增殖、凋亡和表型的转变均无明显影响,与对照组比较无显著差异性(P>0.05)。第二部分CGRP蛋白直接接触法：MTT结果显示,与对照组比较CGRP蛋白的干预明显抑制了VSMCs的增殖(P<0.05)；同时流式细胞技术检测结果也发现CGRP蛋白干预后的VSMCs早期凋亡增多,停留在静止期的细胞数目较对照组明显增加(P<0.05)；而应用CGRP蛋白干预高表达RAMP1慢病毒载体转染的VSMCs,即CGRP’时,CGRP的上述抑制作用明显增强(P<0.05)；相反,当RAMP1蛋白干预沉默VSMCs,慢病毒载体转染的VSMCsRAMP1+/+即CGRP时,CGRP+/+的上述抑制作用明显减弱(P<0.05)。细胞共培养法：MSCs转染MSCsCGRP+/+), ELISA后(即CGRP法检测结果显示其上清液中MSCsCGRP+/+蛋白分泌量较对照组显著增加(P<0.05)；RAMP1分别与高表达和沉默VSMCs的CGRP共培养后,CGRP所表现出的作用与Western blot蛋白直接接触法结果是一致的。同时,MSCscgrp+/+结果还显示：VSMCs与VSMCs共培养能够促使a-SM-actin中收缩型蛋白MSCsCGRP+/+表达增高,合成型OPN表达降低(P<0.05)；当RAMP1与高表达VSMCs的MSCsCGRP+/+共培养时上述表性改变显著增加(P<0.05)反之；当RAMP1与沉默VSMCs的共培养时则上述表性改变显著减弱(P<0.05)。结论第一部分高表达RAMP1能明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖,促进细胞早期凋亡,同时影响细胞表型转变。而沉默RAMP1后,上述作用减弱,由此说明RAMP1对VSMCs具有一定的抑制作用。第二部分高表达或沉默RAMP1的VSMCs可改变细胞对CGRP的敏感性,即高表达RAMP1可增强CGRP对VSMCs增殖的抑制作用并促进细胞凋亡,同时抑制细胞表型由收缩型向合成型转变；反之,沉默RAMP1则可减弱CGRP对VSMCs的上述作用。此结果进一步说明RAMP1是CGRP发挥生物学效应的关键肽；细胞共培养结果证明了CGRP转染至MSCs后,能够高分泌CGRP,并可稳定发挥CGRP的生物学效应,由此,上述结果为CGRP修饰MSCs的体内移植提供了体外实验的支持。