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原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国第二大恶性致死肿瘤,其发病率和死亡率有逐年上升的趋势。肝癌的发病十分隐匿,导致发现晚,预后差。提高肝癌患者存活率的重要措施就是“早发现、早诊断、早治疗”。目前,国内外大量文献中,均涌现出很多肝癌诊断标志物。为了开展肝癌的免疫诊断和治疗,我们根据现有的文献调研,选择了11中肝癌相关标志物,有目的的从不同的癌细胞中成功克隆了11种各种基因的cDNA,他们分别是MAGEA1、MAGEA2、MAGEA6、MAGEA10、GPC3、GP73、HCA519、HCA661、CTp11、TPTE和PTEN。其中MAGEA1和MAGEA10在我国肝癌患者中的有较高的表达比率,分别为66%和36.7%,是最有可能的肝癌疫苗候选分子。GPC3和GP73是目前最有希望的肝癌诊断候选标志物,并且与AFP的表达并无相关性,可与APF联合应用以提高肝癌的诊断率。HCA519和HCA661是wang等人利用重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)技术筛选到的两种肝癌相关抗原,其中HCA519高表达于肝癌细胞,在前列腺癌、肺癌和胰腺中也有表达,但在正常组织中不表达,是一种核增殖相关的蛋白,仅存在于处于细胞周期的细胞中;HCA661主要表达于睾丸组织,在正常的胰腺中有弱表达,但在其他正常组织中无表达,应属于癌睾抗原,有可能成为候选疫苗,但由于在胰腺中有弱表达,因此,基于HCA661设计的治疗性疫苗应首先考察其对胰腺的毒性。CTp11首先被发现表达于黑色素瘤细胞中,该抗原在肝癌中的表达率高达62.9%,存在潜在的HLA-A2限制性CTL表位,而HLA-A2在亚洲人中的表达率可能超过50%,因此,CTp11也是一种可用于肝癌免疫治疗的候选分子。TPTE1在肝癌患者中的表达率为39%,而肝癌患者血清中存在TPTE1抗体的阳性率达到25%,因此,TPTE1有可能用于肝癌的筛查。PTEN是一种肿瘤抑制基因,在肝癌中表达降低。PTEN正常表达可能对于抑制肿瘤的浸润和迁移具有重要意义,因此,PTEN可用于基因治疗肝癌及其他肿瘤。GPC3是一种新的肝癌标志物,其表达与AFP无相关性。为开展肝癌症的免疫诊断研究,我们在克隆了GPC3 cDNA的基础上,表达并纯化了人血清中可溶性GPC3。可溶性GPC3是GPC3蛋白在358-359位氨基酸残基之间断裂后产生的N端部分释放到血液中的。用纯化的可溶性GPC3免疫小鼠,在血清抗体效价达到1:106后,通过细胞融合技术,将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对阳性克隆进行传代,最终得到了两株能稳定分泌鼠抗人可溶性GPC3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞D1和G6。经鉴定,D1和G6均为IgG1亚类抗体,两株抗体均具有较好的特异性和亲和力,但D1的亲和力更高,可以检测到10 ng/mL的可溶性GPC3,而G6仅能检测到10μg/mL的可溶性GPC3。通过ELISA叠加实验证明,D1和G6识别GPC3不同的抗原表位,可以作为配对抗体用于夹心ELISA以检测病人血清中的可溶性GPC3。另外,通过免疫荧光实验证明,D1和G6能够识别细胞表面表达的GPC3,这表明D1和G6抗体可以用于免疫荧光实验研究。HCCR是另外一种较理想的肝癌诊断标志物,是韩国Ko等通过差异显示RT-PCR从人宫颈癌组织中克隆的一种新的肿瘤相关基因。在肝癌患者血清中,HCCR蛋白含量升高,而在正常人和良性肝病患者的血清中HCCR含量很低。由于前期我们并未能够克隆出HCCR的cDNA,所以,我们采用了另外一种策略制备HCCR的抗体。一般蛋白质的C末端肽具有较好的可及性,常常成为蛋白质的抗原表位。HCCR的C末端八肽(TNYLGTRR)具有较好的亲水性,并且经过比对发现HCCR的C末端八肽在人蛋白质库中具有唯一性,可以作为HCCR蛋白的特异性标签。基于此,我们将HCCR的C末端八肽展示于T7噬菌体表面,每个噬菌体表面展示有415个小肽,用这种重组噬菌体作为HCCR抗原的替代抗原免疫兔,经过四次免疫后,血清抗体效价均达1:105。其中1号兔免疫血清特异性很好,能够特异性识别HCCR的C末端小肽和HCCR167-360蛋白,但2号兔免疫血清的特异性很差,除能够结合HCCR的C末端小肽外,与其他无关蛋白和小肽也有反应,这可能与免疫动物的个体差异有关。Hepatopoietin Cn (HPPCn)是一种新的肝增殖刺激因子,是从小牛肝刺激物(hepatic stimulatory substance,HSS)中分离出来的,属于LANP(leucine-rich acidic nuclear protein, LANP)家族。HPPCn在肝再生过程中发挥着重要作用,它不仅能够激活肝细胞增殖相关的信号通路,刺激肝细胞DNA合成,而且能够缓解CCl4引起的肝损伤。为进一步了解HPPCn的生物学功能,分析其在肝炎、肝硬化及肝癌等肝病发生过程中的动态变化及其与疾病的相关性,我们研制了抗HPPCn的单克隆抗体(mAb)。用纯化好的HPPCn蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,在小鼠抗血清效价达到105后,采用经典的杂交瘤细胞融合技术进行细胞融合,采用间接ELISA检测阳性克隆,经有限稀释法进行亚克隆,最终得到了一株能稳定分泌抗人HPPCn单克隆抗体的杂交瘤细胞W2-D5,该抗体具有很好的特异性,与其他无关蛋白无反应。该抗体还具有较高亲和力,能够检测到低至1ng/ml的HPPCn蛋白;采用噬菌体肽库技术分析了W2-D5抗体所识别的抗原表位,其所识别的抗原表位为HPPCn7-13(IHLELRN)。综上所述,通过本课题研究,我们成功克隆了11种肝癌相关基因,并成功表达、纯化了一种肝癌标志物GPC3,并研制了特异性好和亲和力高的GPC3配对抗体D1和G6;利用替代抗原策略研制了另一种肝癌标志物HCCR的抗血清,该抗血清特异性好,可与鼠源抗体作为配对抗体用于夹心ELISA检测血清中的HCCR。另外,我们还研制了一种肝增殖刺激因子HPPCn的单克隆抗体W2-D5,该抗体能够特异性识别HPPCn蛋白,并具有较高的亲和力,通过噬菌体肽库技术最终鉴定了该抗体所识别的抗原表位。