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泥蚶是我国四大养殖贝类之一,具有重要的经济价值。培育出优良品种是促进泥蚶养殖业可持续发展的关键。分子标记技术的出现为优良品种的快速培育提供了丰富的理论基础。本研究利用线粒体COI技术和AFLP分子标记技术,以泥蚶野生群体及选育群体为实验材料,探讨了泥蚶不同群体的遗传多样性和遗传变异,为分子标记辅助育种及新品种培育提供基础。
1.泥蚶4个地理群体线粒体COI基因序列变异及遗传结构分析
利用线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因测序技术分析了泥蚶4个地理野生种群(韩国釜山-FS、山东东营-DY、江苏如东-RD、浙江乐清-YQ)的遗传结构及遗传多样性。利用特异性引物进行PCR扩增、纯化、测序并进行同源序列比对,在所测34条序列中,得到泥蚶COI基因片段长度为582bp,4个地理群体的T,C,A,G碱基含量平均值分别为21.7%,23.8%,40.1%,14.2%,A+T的含量平均值为61.8%,G+C的含量平均值为38.1%,A+T的含量明显高于C+G的含量,4个群体间的碱基组成没有明显差异。在泥蚶4个地理群体中共发现9个单倍型,在9个单倍型中有12个变异位点,占分析位点总数的2.06%。在泥蚶4个地理群体中,遗传多样性存在着一定的差异。根据平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数的比较结果来看,均是RD>FS>DY>YQ,且仅有RD群体单倍型指数大于0.9,表现出了丰富的遗传多样性。而YQ群体的遗传多样性指数相对偏低,这可能与浙江乐清地区泥蚶的大规模养殖有关。泥蚶不同地理群体的遗传多样性的研究,可为以后更合理的开发、利用泥蚶资源打好基础,使其泥蚶养殖业达到可持续发展的目标。
2.泥蚶生长性状相关AFLP分子标记的筛选
利用群体选育的方法,本课题组选育出了快速生长品系,同样的生长环境下,选育品系在壳长、壳高、壳宽、总重等都表现出了显著的生长优势。为研究遗传结构变异,筛选出与生长相关的分子标记,本实验利用AFLP分子标记技术对泥蚶快速生长品系和对照组群体的64个个体基因组DNA进行了PCR扩增和电泳检测。从63对引物组合中筛选出了40对扩增效果较好的引物组合,40对引物在64个个体中共扩增出2180条带谱,多态性比例85.6%。从Neis基因多样性和Shannons信息指数上来看,遗传多样性均是选育群体>对照组,说明选育群体遗传多样性水平较高。泥蚶选育群体与对照群体的遗传距离较小(0.0113),这表明经过一代的选育,群体间遗传差异较小,亲缘关系很近。遗传分化系数Gst=0.0224,基因流Nm=22.2811,说明遗传变异较小,群体间存在明显的基因流动。在2180条带中共筛选出了11个显著性差异的位点。在所有显著差异的位点中,2个位点只在选育品系中出现,出现频率分别为0.8125,0.3438,有7个位点在选育品系中出现的频率显著高于对照组,另有2个位点在对照组出现的频率显著高于选育品系。这些标记可能与泥蚶生长性状相关。这些与生长相关分子标记的获得为泥蚶生长性状的QTL定位、分子标记辅助育种、生长相关基因的克隆奠定基础。
3.泥蚶4个快速生长家系的遗传变异分析
利用AFLP分子标记技术对泥蚶4个快速生长家系(J5♂×Z19♀早、Z7♂×J26♀、S1♂×Z3♀、S6♂×Z22♀)的遗传结构及遗传差异进行了分析。用筛选出的9对引物组合(FA5M51、FA2M62、E33M55、E32M51、E33M62、E32M62、E32M58、E33M48、E42M48)在4个家系共124个个体中扩增出506个位点,多态位点比例72.53%。遗传结构分析表明,4个家系的多态位点比例为51.14%~60.75%。从Nei基因多样性指数和Shannon’s信息指数反映的遗传多样性来看,4个家系的遗传多样性由大到小依次为J5♂×Z19♀>S6♂×Z22♀>S1♂×Z3♀>Z7♂×J26♀。基因分化系数Gst和AMOVA分子方差分析表明,38.37%的变异来自家系间,而61.63%的变异来自家系内个体间,可见遗传变异主要来源于家系内个体间。4家系间总遗传分化指数Fst=0.3837,说明家系间已发生了一定程度的遗传分化。遗传距离和聚类分析表明,J5♂×Z19♀与其它3个家系间的遗传距离均较大(0.1201~0.1254),单独分出一支,而S1♂×Z3♀与S6♂×Z22间的遗传距离最小(0.0896),首先聚在一起。另外,在4个家系的指纹图谱中找到了40个特征性标记,其中家系J5♂×Z19♀有15个特征性标记,S6♂×Z22♀有3个特征性标记,S1♂×Z3♀有14个特征性标记,Z7♂×J26♀有8个特征性标记,这些标记可作为家系鉴别的分子标记。依据家系的遗传多样性和遗传差异分析,可有效预测快速生长家系选育的最佳亲本配组,为分子标记辅助泥蚶家系选育提供科学理论依据。