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背景热休克转录因子1(heat shock transcription factor1, Hsfl)是热休克因子家族中的成员之一,热休克家族成员包括Hsfl,Hsf2, Hsf3和Hsf4。这个家族成员具有保守的DNA结合结构域,能够识别并且与位于靶基因启动子区域的热休克元件(heatshockelement, HSE)结合。Hsfl是热休克反应的主要调控者,在热休克或其他应激条件下,失活的Hsfl高度磷酸化,Hsfl被激活并移位至细胞核,转变成三聚体与HSE结合,可刺激热休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)的转录。Hsfl介导的热休克反应不仅保护细胞免受环境或细胞内应激引起的损伤,而且涉及到对许多病理过程的调节,如炎症和肿瘤的形成。众多研究表明,在肿瘤形成和发展的调节过程中,Hsfl起了非常重要的作用,例如,Hsfl和其相关的下游靶蛋白(如HSPs)在大多数癌组织中是增高的。Hsfl敲除能够抑制DMBA诱导的皮肤癌、p53突变诱导的淋巴瘤和DEN诱导的肝细胞癌,抑制HSP90分子伴侣的活性能够诱导肿瘤细胞的凋亡。这些证据表明,Hsfl和其调节的热休克反应能够稳定快速增殖的肿瘤细胞。虽然,已经发现Hsfl与p53和Ras癌基因诱导的肿瘤形成有关,而Hsfl在病毒性癌基因诱导形成肿瘤中的作用还不清楚。SV40是双链的DNA肿瘤病毒,已经从HIV阳性的非何杰金氏淋巴瘤病人组织中分离出来。SV40能够表达两种早期的癌蛋白小t抗原(t-antigen, t-ag)和大T抗原(T-antigen, T-ag), T-ag通常被用作转基因肿瘤鼠模型和用于转化细胞的体外研究。T-ag通过与p53和Rb相互作用和灭活肿瘤抑制因子p53和Rb的活性,能够使很多种细胞发生转化。本课题中我们研究Hsf1在SV40T-ag转化鼠胚胎成纤维细胞中的作用。结果发现SV40T-ag转化的WT/MEF细胞,MEF/Hsfl-/-细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl(重新构建的Hsf1导入MEF/Hsfl-/-细胞)在裸鼠能够形成成纤维细胞瘤,但是MEF/Hsfl-/-细胞和裸鼠肿瘤的生长明显比WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞慢。结果表明,Hsfl参与了刺激SV40T-ag转化细胞的增生。进一步研究表明,Hsfl缺失导致p53和Rb蛋白的蓄积,这可能与MEF/Hsfl-/-细胞生长的慢有关。我们的研究结果证实了Hsfl涉及SV40T-ag诱导肿瘤形成的调控,而SV40T-ag引起肿瘤的形成是通过调控p53和pRb蛋白的表达。目的1.观察Hsfl表达的缺失在SV40T-ag诱导肿瘤形成中的作用。2.探讨Hsfl能够刺激SV40T-ag引起肿瘤的形成,是否通过调控p53和pRb蛋白的表达引起。方法1.质粒的构建：鼠Hsfl的cDNA与N末端的Flag-tag在EcoRI亚克隆到逆转录病毒载体pWZL-blast,形成重组质粒pWZL-blast-Flag-hsfl,重建MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞系。质粒pWZL-blast-Flag-hsfl瞬时转染293Phoenix细胞,转染后48小时,收集含有病毒颗粒的上清,感染SV40T-ag转化的MEF/Hsfl-/-细胞。选用含3ug/ml的blasticitidine(?)勺培养基培养细胞3-4天,Hsfl重新进入MEF/Hsfl-/-细胞,建成MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞系。将人Hsfl的shRNA构建到逆转录病毒载体pLTHR,形成pLTHR-shRNA-Hsfl,shRNA瞬时转染进入H1299和HEK293T细胞,沉默Hsfl基因的表达。2.通过体外细胞克隆形成实验,MTT实验,流式细胞术,裸鼠皮下移植瘤实验分析SV40T-ag转化的WT/MEF细胞,MEF/Hsfl-/-细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞的增殖和肿瘤的形成。3.用免疫组织化学的方法检测VEGF.CD34和FⅧ.RAg在WT/MEF细胞,MEF/Hsfl-/-细胞和MEF/Hsfl-/-Hsfl细胞形成移植瘤组织中的表达,判断Hsfl在肿瘤血管形成中是否有作用。4.通过免疫印迹实验,用合适的抗体研究Hsfl,SV40T-ag,p53,pRb,HSP90, HSP70,HSP25等蛋白的表达；通过免疫共沉淀实验观察SV40T-ag与HSP70,pRb或p53的相互作用。结果1.重建MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞系为了避免WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-细胞之间同胎仔畜的差异,我们用逆转录病毒表达鼠Hsfl全长的cDNA感染MEF/Hsfl-/-细胞,重建MEF/Hsfl-/-/sfl细胞系。通过western blot实验,结果证实Flag-Hsfl在MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞中有表达,在WT/MEF细胞中出现内源性Hsfl的表达,而在MEF/Hsfl-/-细胞中没有Hsfl的表达。2.Hsfl的缺失抑制MEF/Hsfl-/-细胞的增生通过MTT实验和细胞克隆形成实验,观察WT/MEF细胞、MEF/Hsfl-/-细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞三种细胞的增殖情况。我们的实验结果证明,MEF/Hsfl-/-细胞明显比WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞生长的慢(T test,P<0.05), WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞之间没有明显差异(T test,P＞0.05).细胞克隆实验结果证实,MEF/Hsnfl-/-细胞形成的克隆明显比WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞少(t-test,P<0.001)。此外,通过流式细胞术,我们分析这三种细胞系的细胞周期,发现在G0/G1期,WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-Hsfl细胞的百分数明显低于MEF/Hsfl-/-细胞(T test,P<0.01):但是,在S期和G2/M期,WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞的百分数明显高于MEF/Hsfl-/-细胞(T test. P<0.05)。我们的实验结果证实,Hsfl参与了调控SV40T-ag转化的MEF细胞的增殖。3.Hsfl的缺失能够抑制MEF细胞形成裸鼠成纤维细胞瘤的生长为了探讨Hsfl在肿瘤形成中是否有作用,将三种MEF细胞系接种到裸鼠皮下。在接种裸鼠26天后,三种MEF细胞系都能形成肿瘤。然而,WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞移植瘤的生长明显比MEF/Hsfl-/-细胞快；WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞移植瘤的重量和体积明显比MEF/Hsfl-/-细胞重和体积大(Ttest,P<0.05).在WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞接种移植瘤的裸鼠中出现肺转移灶,而MEF/Hsfl-/-细胞形成肿瘤的裸鼠中没有发现肺转移。然而,VEGF. CD34和FⅧ.RAg在WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞形成瘤组织中的表达明显多于MEF/Hsfl-/-细胞形成的肿瘤(T test,P<0.05).所有这些结果证明,Hsfl对SV40T-ag诱导的肿瘤的生长和转移具有调控作用,但是对肿瘤的起始没有作用。4. Hsfl与p53和Rb蛋白的表达有关SV40T-ag转化细胞是通过SV40T-ag与p53和pRb的结合,灭活p53和pRb的活性。由于Hsfl的缺失能够抑制SV40T-ag转化细胞的生长,导致细胞周期阻止在G1/G0期。因此,我们推测Hsfl可能与p53和Rb信号通路有关。我们的western blotting实验结果显示,与WT/MEF和MEF/Hsfl-/-/THsfl细胞及裸鼠瘤组织相比,在MEF/Hsfl-/-细胞和裸鼠瘤组织中Rb,p53,p21,HSP25和SV40T-ag的表达是上调的(T test,P<0.05);但是,在三种MEF细胞和肿瘤组织中Hsp70, hsp90和Hsc70的表达没有变化(T test,P>0.05)。为了探讨Hsfl对p53和Rb的调控作用,我们用shRNA技术沉默HEK293T细胞中Hsfl的表达,HEK293T细胞表达SV40T-ag,结果显示,沉默Hsfl的HEK293T细胞出现p53,pRb和SV40T-ag蛋白表达的上调(T test,P<0.05)。结果显示,Hsfl涉及调控p53, pRb和SV40T-ag蛋白的表达。为了研究p53, pRb和SV40T-ag之间的相关性,我们瞬时转染shRNA-Hsfl和SV40T-ag进入H1299细胞,H1299细胞是p53阴性的细胞,这对于研究Hsfl对Rb和SV40T-ag的作用更加方便。我们的结果显示,沉默Hsfl的H1299细胞导致Rb和SV40T-ag蛋白的表达上调(T test,P<0.05)。上述结果显示,Hsfl具有调控p53和pRb蛋白的表达。SV40T-ag是一种能够与p53和pRb结合引起细胞转化的癌蛋白。在Hsfl缺失细胞中p53, pRb和SV40T-ag皆上调,提示这三种蛋白之间的相互作用存在着某些错误。我们的免疫共沉淀实验结果显示,与转染scramble shRNA的HEK293T细胞相比,在Hsfl沉默的HEK293T细胞中SV40T-ag和p53,SV40T-ag和pRb之间的相互作用弱。总之,我们的研究结果显示,Hsfl缺失能够调控p53,Rb和SV40T-ag蛋白的表达,破坏SV40T-ag与p53或pRb的相互作用,抑制细胞的增殖。结论1.重新构建pWZL-blast-Flag-Hsfl和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞系,有助于搞清楚Hsfl在SV40T-ag诱导肿瘤形成中的作用。2. Hsfl表达的缺失不能阻断SV40T-ag转化细胞形成肿瘤,但是可以抑制肿瘤的生长。3. Hsfl的缺失引起肿瘤组织中血管生成的减少,上调p53, pRb和SV40T-ag蛋白的表达,破坏SV40T-ag与p53或pRB蛋白的结合,结果抑制了SV40T-ag转化细胞和肿瘤的生长。