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随着人类社会的发展,地球上的石油、煤炭等化石能源将逐渐枯竭,人们将会面临资源匮乏所带来的挑战。纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子,是人类最宝贵的天然可再生资源,可以作为目前亟待开发的新型生物质资源,已经逐渐成为人们强烈关注的热点,同时对木质纤维素的高效利用也被越来越多的人所重视。自然界中存在多种多样的可降解纤维素的微生物,其降解纤维素的机制也呈现出多样性。好氧细菌Cytophaga hutchinsonii表现出高效彻底的降解结晶纤维素的能力,但其机理却与真菌和厌氧细菌的明显不同,被认为是拥有一种特殊的降解机制。为了进一步阐明Cytophaga hutchinsonii降解纤维素的机理,本文首次建立了对该菌的电击转化方法,在此基础上通过基因敲除技术获得了突变株,并对突变株的性质进行了初步研究。另外,为了满足自体表达体系构建的要求,建立了启动子基因文库进而筛选到一些活性较强的启动子,最后利用筛选到的启动子作为表达元件初步建立了自体表达体系。本文的主要内容及结果如下：1、C. hutchinsonii的电转化方法的建立及优化针对该菌现有的遗传转化方法的不足,首次建立了一种哈氏噬纤维菌的电转化方法。通过对哈氏菌的培养条件、生长状态、电击缓冲液、电场强度、质粒浓度、复苏时间等因素进行优化,得到电转化的最优条件并提高了电转化效率,对于本实验室构建的可复制质粒pEPO293来说电转化效率可达到5×104转化子／μ g DNA。该方法操作简单,稳定性和重复性较好,为外源基因导入C.hutchinsonii以及C. hutchinsonii的基因敲除等研究工作提供了一种新的工具。2、C. hutchinsonii基因缺失突变株的构建及性质研究针对C. hutchinsonii中的外膜蛋白基因（CHU3732）,构建了敲除用自杀型质粒pLYL033732,通过电转化方法成功筛选到了CHU3732基因缺失突变株。进一步对突变株性质进行初步研究,发现突变株对于纤维素的降解能力明显下降；在0.5%和1%琼脂浓度的平板上突变株的扩散能力发生缺陷,但是突变株对纤维素的吸附率较野生型无明显变化。该基因影响运动和纤维素降解的机理尚不清楚,通过对该蛋白的初步定位,未发现其存在暴露于细胞壁外的结构,推测它不直接参与对纤维素的吸附,可能在参与运动和纤维素降解的物质的运输中发挥作用。3、C. hutchinsonii启动子基因文库的构建及强启动子的筛选以无启动子区的gfp基因作为报告基因,构建了转座子探针捕获质粒pUCTn19,电转化C. hutchinsonii后,质粒上的转座子序列会随机插入到Chutchinsonii的基因组中,从而可以得到大量突变子,通过检测荧光强度的方式从启动子文库中筛选强启动子。最终获得了4个有较强转录活性的启动子片段,为建立其自身的表达体系或回补系统奠定了基础。4、C. hutchinsonii自体表达体系的初步构建C. hutchinsonii的纤维素酶难以在大肠杆菌中获得活性表达,我们采用筛选到的OmpA启动子作为表达元件,以C. hutchinsonii中的内切纤维素酶CHU1280作为表达对象,对其在C. hutchinsonii体内进行了过表达,并通过与His tag的融合表达将其从细胞内进行分离纯化,并成功获得了可溶的融合表达蛋白,这为进一步研究相关纤维素酶的特性提供了一个新途径。