研究背景:　　胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，严重危害人类的身心健康。我国预计每年死于胃癌的患者达16万以上，占癌症死亡人数的23％，其死亡率仍居我国的首位。目前胃癌仍以手术治疗为主，但胃癌的早期诊断率很低，大多数患者一经诊断往往已是晚期而失去手术的机会。而全身化疗是晚期胃癌姑息性治疗的主要手段，但目前胃癌的化疗尚没有理想的“金标准”，且毒副作用大。肿瘤热疗是继手术、放射治疗、化学治疗和生物治疗之后的第5大肿瘤治疗手段。尤其在晚期恶性肿瘤或难治性肿瘤治疗方面，其最大优点是无创或微创，可与放化疗具有协同和增敏作用，并又能减轻放化疗的副反应。热疗在肿瘤综合治疗中的地位及意义受到越来越多的关注。大量研究表明诱导细胞凋亡是温热杀伤肿瘤细胞的主要机理之一，但其机制目前尚不清楚。　　C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是机体应激的主要信号转导通路，能被多种刺激因素激活而介导细胞的凋亡。但也有研究显示JNK有抗细胞凋亡的作用，提示JNK信号在细胞应激反应中具有复杂性、多样性。因此目前认为JNK促凋亡或抗凋亡活性可能与细胞类型、死亡刺激以及其它信号通路活性有关。温热属于一种热应激，在温热应激诱导胃癌细胞凋亡中，是否存在JNK的参与及JNK信号起何种调控作用？国内外尚无相关报道。因此，研究JNK在温热诱导胃癌细胞凋亡中的作用及其机制，可能为胃癌的防治提供一个新的靶点，为临床胃癌防治提供科学依据。　　目的:　　1.探讨JNK蛋白在胃癌组织中的表达特点及其与胃癌的临床特征的关系。　　2.探讨温热对胃癌细胞凋亡的影响。　　3.探讨温热对胃癌细胞生物学行为的影响。　　4.探测温热后胃癌细胞的p-JNK以及细胞凋亡相关基因Puma、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白表达和JNK、Bax等mRNA表达。　　5.探讨使用JNK特异性抑制剂SP600125阻断JNK后温热引起细胞凋亡相关基因Puma、P53、Bcl-2、Bax和Caspase-3等蛋白表达和JNK、Bax等mRNA表达变化及其可能的机制。　　材料和方法:　　1.研究材料:①临床标本:胃癌标本59例，②胃癌细胞系:MKN45、SGC7901。　　2.温热细胞模型温度选择:43℃。　　3.细胞损伤的形态学改变:应用倒置显微镜观察及透射电镜观察。　　4.细胞活力的检测:采用四唑蓝(MTT)比色试验。　　5.细胞凋亡的检测:采用Hoechst-33258荧光染色、AO/EB荧光双染色、AnnexinV/PI双染色流式细胞术和TUNEL方法。　　6.细胞周期的检测:采用AnnexinV/PI双染色流式细胞术方法。　　7.细胞运动迁移能力的检测:采用细胞划痕愈合实验。　　8.细胞侵袭能力的检测:采用Transwell实验。　　9.胃癌组织及细胞的JNK信号通路相关蛋白的检测:采用免疫组织化学PV-9000方法及Western blotting方法。　　10.胃癌细胞JNK信号通路相关基因mRNA的检测:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法。　　11.胃癌细胞JNK信号的调控:采用JNK特异性抑制剂SP600125阻断的方法。　　结果:　　1.JNK在人胃癌组织中的表达:　　JNK在胃癌组织中均有表达，在高、中、低分化胃癌组织中，阳性率分别为92.9％、70.8％和52.4％，呈明显递减趋势(P＜0.05)，高分化胃癌的JNK表达显著高于低分化胃癌(P＜0.01)，但JNK与年龄、性别、肿块大小、PTNM分期及淋巴结转移无关（均P＞0.05）。　　2.温热对胃癌细胞凋亡的影响:　　(1)倒置显微镜检测结果表明，温热0.5h、1h、2h及3h后两株胃癌细胞（SGC7901和MKN45）均明显皱缩、变圆及细胞漂浮，1h细胞形态损伤略轻于0.5h，2h细胞皱缩、变圆、漂浮明显增多，3h大部分细胞出现漂浮，但SGC7901细胞皱缩、变圆、漂浮的比例高于MKN45细胞。　　(2)透射电镜观察结果表明，温热0.5h、1h后部分SGC7901细胞可见核仁增多，胞核及胞质可见大小不等的空泡，1h细胞形态损伤略轻于0.5h，2h细胞核固缩、染色体发生边集及空泡变性明显，可见多量凋亡小体。　　(3)流式细胞仪检测结果显示，温热0.5h、1h、2h和3 h SGC7901细胞凋亡率分别为7.3％、46.5％、39.9％、56.6％和50.4％，MKN45细胞凋亡率分别为8.8％、31.7％、26.7％、46.1％和41.8％，两株细胞温热1h细胞凋亡率低于0.5h，但SGC7901细胞各温热时间组的细胞凋亡率高于MKN45细胞相应温热时间组的细胞凋亡率(P＜0.05)。　　(4) Hoechst-33258荧光染色结果显示，与对照组相比，温热0.5h、1h、2h和3h细胞核内出现浓染致密的颗粒块状荧光，显示出胞核固缩、染色质高度凝聚和碎裂，并且温热1h胞核的变化轻于0.5h，2h又明显加重。　　(5) AO/EB荧光双染色结果显示，与对照组相比，温热0.5h和2h细胞凋亡数量明显增多，且1h凋亡率低于0.5h，3h细胞凋亡减少，而细胞坏死数量增多。　　(6) TUNEL检测结果显示，温热0h、0.5h、1h、2h和3h后SGC7901细胞和MKN45细胞凋亡率分别为12.2％、48.2％、40.1％、61.2％、52.0％和11.3％、42.7％、33.4％、48.8％、44.3％;各温热时间组（除0h外）的SGC7901细胞凋亡率明显高于MKN45细胞相应温热时间组的细胞凋亡率(P＜0.05)，并且温热1h后细胞凋亡率低于温热0.5h。　　3.温热对胃癌细胞的生物学行为的影响:　　(1) MTT结果显示，温热0.5h、1h、2h和3h后SGC7901和MKN45细胞抑制率分别为32.7％、30.6％、43.8％、52.9％和23.0％、18.7％、33.8％、39.9％，上述两株细胞温热1h后细胞抑制率低于0.5h。提示温热可杀伤胃癌细胞，且对SGC7901细胞杀伤作用强于MKN45细胞(P＜0.05);胃癌细胞自身对温热会产生一定的应激能力。　　(2)细胞划痕愈合实验结果显示，SGC7901细胞温热1、2h后24h的细胞迁移距离分别为489.0±13.5pixels、254.0±19.7pixels，均小于37℃对照组的细胞迁移距离689.1±9.8pixels(P＜0.05)，SGC7901细胞加热1、2h后48h的细胞迁移距离分别为707.0±18.4pixels、259.7±17.3pixels，均明显小于37℃对照组的细胞迁移距离984.0±21.3pixels((P＜0.01)，温热3h后细胞基本未发生迁移。　　(3)体外侵袭实验（Transwell实验）结果显示，SGC7901细胞温热3h后细胞侵袭能力下降最明显，对照组和温热0.5h、1h、2h、3h后，平均每个视野SGC7901细胞穿过Matrigel胶到达Transwell小室膜背面的细胞数分别为44.4±0.81、30.5±1.05、34.0±1.36、20.5±0.91、8.4±0.92，与对照组比较均具有差异(P＜0.05)。　　(4)流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，SGC7901细胞各温热时间组的G0-G1期细胞均增多(P＜0.05)，而S期细胞减少(P＜0.05)，各温热时间组的MKN45细胞周期变化不显著(P＞0.05)。　　4.温热后胃癌SGC7901细胞的p-JNK及细胞凋亡相关基因Puma、P53、Bcl-2、Bax和Caspase-3等蛋白表达:　　Western blotting结果显示，与对照组的细胞p-JNK、Puma、Bax和Caspase-3的蛋白表达水平比较，0.5h至2h各时间组的细胞p-JNK、Puma、Bax和Caspase-3的蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05);2h组达最高峰，1h组低于0.5h组，3h组的细胞上述指标明显回落(P＜0.05); Bcl-2表达在温热0.5h组增高，1h组达高峰，而后明显下降。提示温热诱导胃癌SGC7901细胞凋亡过程中p-JNK、Puma、Bax和Caspase-3等蛋白均被激活;而Bcl-2作为抗凋亡蛋白，在温热刺激过程中开始增高，而后下降，可能是一种保护作用。P53蛋白未表达，其原因可能是野生型P53半衰期短，难以检测到。　　5.温热后胃癌SGC7901细胞的JNK及Bax的mRNA表达:　　RT-PCR结果显示，与对照组的JNK、Bax的mRNA表达水平比较，0.5h至2h各温热时间组的JNK、Bax的mRNA表达水平明显升高(P＜0.05);2h组达最高峰，1h组低于0.5h组，3h组的细胞上述指标明显回落(P＜0.05)。其结果与Western blotting检测相应蛋白的结果相一致。　　6.探讨JNK特异性抑制剂SP600125阻断JNK后引起细胞形态及凋亡相关基因Puma、P53、Bcl-2、Bax和Caspase-3等蛋白和JNK、Bax的mRNA表达变化及其可能的调控机制。　　(1)倒置显微镜及TUNEL检测结果表明，与阴性对照组相比，SP600125处理后各温热时间组对细胞的杀伤作用明显减弱(P＜0.05)。　　(2) Western blotting结果显示，与阴性对照组相比，SP600125处理后各温热时间组的p-JNK、Puma、Bax和Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P＜0.05);Bcl-2蛋白表达仍是先增高而后降低;P53蛋白未见表达。　　(3) RT-PCR结果显示，与阴性对照组相比，SP600125处理后细胞各温热时间组的JNK、Bax的mRNA表达水平明显降低(p＜0.05)，其结果与Westernblotting检测相应蛋白的结果相一致。　　结论:　　1.胃癌组织中存在JNK表达，并且JNK的表达随胃癌分化程度增高而增高(P＜0.05)，而与年龄、性别、肿块大小、PTNM分期及淋巴结转移无关(均P＞0.05)。　　2.温热可诱导胃癌细胞凋亡，温热诱导胃癌SGC7901细胞凋亡作用明显强于MKN45细胞(P＜0.05)。　　3.温热对胃癌细胞杀伤作用与胃癌细胞的分化程度有关，温热对高中分化胃癌细胞的杀伤作用明显强于对低分化胃癌细胞的杀伤作用(P＜0.05)。其原因可能与低分化胃癌细胞的JNK的表达低有关。　　4.温热可明显抑制胃癌SGC7901细胞增殖和侵袭迁移能力。　　5.温热诱导胃癌细胞凋亡可能是通过激活JNK信号传导通路而上调Puma、Bax和Caspase-3的表达得以实现。