癫痫是由各种原因导致的脑细胞群异常放电所致的暂时性、发作性的脑功能障碍综合征，中国目前至少有700多万癫痫患者，其中约有20%的癫痫患者为药物难治性癫痫，成为临床治疗中的难点。长期发作不仅严重影响了癫痫患者的生活质量，也给患者家庭及社会带来巨大的负担和压力。目前，药物难治性癫痫的治疗主要采取外科手术，但是外科手术只是切除患者致痫灶的发作起始区，并没有完全改变脑内神经细胞的高兴奋状态和相关离子通道的异常，同时，外科手术本身冒着一定的风险，如麻醉意外、出血、感染、肢体偏瘫等。随着对该癫痫发病机制认识的深入以及分子生物学技术的发展，基因治疗为彻底治愈癫痫带来新的希望。资料显示，神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)主要分布在中枢神经系统大脑皮层、海马、丘脑、纹状体等处，NPY及其受体与癫痫的发生密切相关，受到广泛的注意，其在各种癫痫模型中的作用非常复杂，常因动物模型不同或给药途径的不同出现不一致甚至相互矛盾的实验结果。本研究以神经肽Y为治疗基因，以重组腺相关病毒为载体，将NPY基因转染到脑组织特定靶区，观察NPY基因过表达对红藻氨酸诱导慢性致痫大鼠发作的影响，并进一步运用PCR、免疫印迹法、微透析技术、膜片钳技术来分析NPY调控癫痫发作的生物学机制。第一部分重组腺相关病毒神经肽Y基因在慢性癫痫模型大鼠脑内的表达目的：比较脑室注射和海马注射两种不同途径, rAAV2/1-NPY-EGFP在致痫大鼠脑组织中的表达情况。方法：选取造模成功的36只大鼠,随机分为二组:海马注射组和脑室注射组,每组18只。运用立体定向技术将rAAV2/1-NPY-EGFP基因转染至脑内，脑组织冰冻切片，荧光显微镜rAAV2/1-NPY-EGFP表达情况，检测rAAV2/1-NPY-EGFP阳性细胞表达体积及灰度值。结果：海马注射组和脑室注射组在注射后2w未见有rAAV2/1-NPY-EGFP表达;在注射后4w,脑室注射组rAAV2/1-NPY-EGFP的表达体积和阳性细胞灰度值均高于海马注射组，经统计学分析差异有显著性(P<0.05)。结论：rAAV2/1-NPY-EGFP在癫痫病理状态下脑组织中可以实现有效表达。脑室注射途径优于海马注射途径。第二部分重组腺相关病毒神经Y基因转染对慢性癫痫大鼠行为学、脑电图及病理形态学的影响目的：探讨rAAV2/1-NPY-EGFP基因转染对癫痫发作、EEG以及病理形态学方面的影响方法：造模成功后将实验动物随机分为4组：对照组：海马CA3区注射等量的生理盐水；KA组大鼠海马CA3区注射KA，不注射病毒；rAAV2/1-empty-EGFP组大鼠在慢性模型成功后，向脑室注射10μ l的rAAV2/1-empty-EGFP，滴度为5×1011v.g./ml；rAAV2/1-NPY-EGFP组，大鼠在慢性模型成功后，向脑室注射10μl的rAAV2/1-NPY-EGFP，滴度为5×1011v.g./ml。分别于注射后2、3、4w观察实验大鼠的EEG上癫痫波的放电频率和波幅，癫痫发作程度以及发作潜伏期，HE染色观察海马CA3区损害神经元数目，透射电镜观察海马CA3区超微结构改变。结果：1随观察时间的延长，rAAV2/1-NPY-EGFP组大鼠发作程度逐渐减轻，和KA组和rAAV2/1-empty-EGFP组大鼠相比较，4W时，癫痫大鼠发作症状减轻明显，潜伏期延长，脑电图上癫痫波的放电频率减少，波幅减低。2HE结果显示在基因转染后2-4w，对照组大鼠海马CA3区神经元形态大致正常，KA组和rAAV2/1-empty-EGFP组大鼠海马CA3区正常神经元数目明显减少，表现为神经元排列稀疏，细胞肿胀变性，核仁比较模糊，胞浆淡染。胶质细胞不同程度增生。rAAV2/1-NPY-EGFP组在2、3w时表现为神经元不同程度数目减少，而在4w时，细胞损伤的程度减轻，轻度细胞肿胀变性，细胞排列疏松，轻度胶质细胞增生，与KA组和rAAV2/1-empty-EGFP组相比，损害神经元数目减少，差别具有显著性(P<0.05)。3透射电镜结果提示，对照组大鼠海马CA3区结果正常；KA组和rAAV2/1-empty-EGFP组大鼠海马神经元数量减少，胞浆浓缩。核浓缩、异染色质增多及边缘化，核周隙扩张，残存神经元显著变性，坏死区周围有小胶质细胞增生。线粒体水肿多见，嵴排列紊乱或断裂，大部分线粒体嵴缺失。rAAV2/1-NPY-EGFP组神经元轻度变性水肿，线粒体轻度水肿，嵴完整。结论：rAAV2/1-NPY-EGFP基因转染能有效控制癫痫发作，缓解海马区病理学改变，为临床上NPY基因治疗癫痫提供了试验依据。第三部分重组腺相关病毒神经肽Y基因转染对慢性癫痫大鼠中枢神经递质影响的动态研究目的：探讨rAAV2/1-NPY-EGFP基因转染对大鼠海马细胞外液中枢神经递质的影响。方法：将4组实验动物于不同时间点，运用微透析技术收集30μL透析液，高效液相色谱荧光法测定大鼠海马微透析液中Glu和γ-GABA浓度。结果：rAAV2/1-NPY-EGFP组在基因转染后2w、3w时，微透析中Glu浓度与KA和rAAV2/1-empty-EGFP组两组比较无明显差异(P＞0.05)；但是在第3w时，微透析中Glu浓度已经有所降低；在第4w,微透析中Glu浓度有明显降低，rAAV2/1-NPY-EGF组为28.36±1.68μmol/L，KA组和rAAV2/1-empty-EGFP组分别为63.00±2.85μmol/L和59.05±8.35μmol/L，下降了约50%，经统计学分析有显著性差异(P＜0.05)。结论：rAAV2/1-NPY–EGFP基因转染抑制了癫痫大鼠的兴奋性氨基酸的释放，NPY对中枢神经递质的调控参与了抑制癫痫发作的机制。第四部分重组腺相关病毒神经肽Y基因转染对慢性癫痫大鼠NMDA受体亚单位表达的影响目的：探讨rAAV2/1-NPY-EGFP基因转染对大鼠海马NMDA受体影响。方法：将4组动物于注射后2、3、4w取材，荧光定量PCR技术检测大鼠海马NMDA受体亚基NR1、NR2A及NR2B的mRNA表达，免疫印迹法检测NMDA受体各个亚基的蛋白表达。结果：1KA组、rAAV2/1-empty-EGFP组和rAAV2/1-NPY-EGFP组大鼠在注射后2、3、4w NPY升高，与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。在注射后4w，rAAV2/1-NPY-EGFP组NPY的m RNA及蛋白表达均高于KA组和rAAV2/1-empty-EGFP组。2在注射后2、3、4w，KA组和rAAV2/1-empty-EGFP组海马NMDA受体亚基NR1、NR2A及NR2B mRNA及蛋白表达均显著升高，与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。rAAV2/1-NPY-EGFP组海马NMDA受体亚基NR1、NR2A及NR2B m RNA及蛋白表达逐渐降低，于4w时，与KA组和rAAV2/1-empty-EGFP组相比，有显著性差异(P＜0.05)。结论：rAAV2/1-NPY–EGFP基因转染抑制了癫痫大鼠海马NMDA受体的表达，NPY有可能通过下调海马NMDA受体亚单位的表达水平来发挥抗癫痫治疗和神经保护作用。第五部分神经肽Y对海马神经元癫痫样放电的抑制作用目的：探讨NPY对原代培养神经元癫痫样放电的影响。方法：用无镁细胞外液处理原代培养12d海马神经元3h，诱导海马神经元癫痫样放电，建立海马神经元癫痫样放电模型；用全细胞膜片钳电流钳模式检测神经元动作电位，分别给予0.1μM和1μM NPY10s，观察其对神经元动作电位频率及波幅的影响。结果：1无镁细胞外液处理神经元3h，可以形成稳定的海马神经元癫痫样放电模型，频率16~23个/s，波幅75~96m V。2与给药前相比，两种浓度NPY均可降低动作电位发放的频率和波幅(P＜0.05)；两种浓度NPY之间相比较，也有显著性差异(P＜0.05)。1μM NPY明显抑制了动作电位发放的频率和波幅。结论：NPY能够抑制无镁细胞外液诱发的神经元癫痫样电活动，为应用NPY抑制癫痫发作提供了细胞电生理学证据。第六部分神经肽Y对海马癫痫神经元NMDA诱导电流的影响目的：探讨NPY对海马神经元NMDA诱导内向电流的影响方法：首先建立海马神经元癫痫样放电模型，然后用膜片钳电压钳模式检测不同浓度(0.1μM和1μM)NPY给药对100μM NMDA诱导内向电流的影响。结果：NPY可以抑制海马癫痫样神经元NMDA诱导的内向电流。其效应具有浓度依赖性。结论：NPY有可能通过调节海马癫痫样神经元的NMDA受体活性来降低神经元兴奋性，发挥抗癫痫作用。