人溶菌酶(human lysozyme, hLYZ)参与机体的防御机制,有抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用,因此在医学、食品工业等领域得到十分广泛的应用。天然hLYZ一般是从人乳、中性粒细胞或尿液中少量提取,但由于来源极其困难,提取方法复杂,且安全性得不到保障,不能进行大规模工业化生产。转基因动物乳腺生物反应器具有表达水平高、表达产物活性强、易于纯化和无污染等优点,是大规模生产重组蛋白的新途径。因此,本研究以奶牛β-酪蛋白基因调控区为指导元件,以人溶菌酶(hLYZ)cDNA为表达序列,构建了乳腺特异性表达载体pEBH。转染小鼠乳腺癌细胞EMT6,筛选获得稳定表达株,并对表达产物进行SDS-PAGE分析及Western blot检测。相关结果如下:1.通过RT-PCR技术成功的从人胎盘组织中扩增出长度为853 bp的hLYZ基因cDNA,包含完整的编码序列。经序列分析表明,片段与GenBank中登录的人hLYZ cDNA序列的同源性为99%。在读码框内,只有三个碱基发生点突变。但分析表明,这三处突变不影响蛋白质功能。2.利用定向克隆的方法,将hLYZ表达序列与改造好的初级乳腺表达载体pBCP融合在一起,然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,最终构建了含有抗性基因和绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的hLYZ非融合型乳腺特异性表达载体pEBH。3.通过脂质体法将表达载体pEBH转入体外培养的小鼠乳腺癌细胞EMT6,经G418抗性筛选,得到的阳性细胞可稳定地表达绿色荧光蛋白,并且主要在细胞质中表达。通过PCR法检测了报告基因表达的阳性细胞,结果表明hLYZ cDNA序列已整合到EMT6细胞染色质中。4.转染细胞增殖后经激素诱导,培养液上清通过SDS-PAGE分析,在约14.7 ku处出现了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带。Western blot检测证明该蛋白是人溶菌酶。