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随着全球人口老龄化趋势的加剧,与年龄相关的神经退行性疾病的发病率显著增加。神经系统退行性疾病均与脱髓鞘有关。少突胶质细胞(Oligodendrocyte,OL)是中枢神经系统唯一的髓鞘形成细胞。少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cell,OPC)作为一种类干细胞,可大量增殖分化为少突胶质细胞。OPC的大量增殖与髓鞘再生密切相关。促进OPC生长,抗脱髓鞘可能是治疗退行性疾病的潜在方法。越来越多的证据表明,星形胶质细胞(Astrocyte,AST)在OPC的增殖中起着重要的作用。我们的研究表明,相对于OPC与AST上清共培养组(CO-OPC组),OPC-AST直接接触培养组(AST-OPC组)OPC的增殖能力显著增强。然而具体机制有待深入探索。我们利用转录组测序和生物信息学分析两组OPC中的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)及功能。结果表明两组OPC中的DEGs主要富集于细胞黏附和外泌体相关的基因。整合素β4(Intergrinβ4,ITGB4)作为重要的黏附分子,在这两组OPC中表达差异显著。用siRNA特异性敲低ITGB4后,AST-OPC组外泌体分泌显著减少,并且OPC增殖能力显著下降。然而在ITGB4敲低后外源性补充外泌体,可以缓解ITGB4敲低对OPC增殖的抑制作用。总之,我们的研究证明了AST可以通过ITGB4介导的细胞间黏附作用促进OPC外泌体分泌并促进其增殖,为脱髓鞘引起的中枢神经系统退行性疾病防治提供了新的思路。本研究分为三个部分:第一部分:AST通过细胞黏附促进OPC增殖本部分通过构建两种OPC与AST体外共培养模型,利用光镜、流式细胞术和EdU检测不同培养条件下OPC的增殖能力;转录组测序检测不同培养条件下OPC的基因表达情况,筛选DEGs,利用DAVID在线分析工具对DEGs进行GO-KEGG pathway功能富集分析。主要结果如下:1、比较AST上清与OPC共培养组(CO-OPC组)和AST与OPC直接接触共培养组(AST-OPC组)两种共培养条件下OPC的增殖能力,光镜、EdU结果显示,AST-OPC组相较于CO-OPC组的OPC细胞数量和新生细胞的比例均显著增加(p<0.01);流式细胞术检测OPC细胞周期结果显示,AST-OPC组处于S期的OPC比例显著增加(p<0.01)。2、转录组测序检测上述两组培养条件下OPC的基因表达情况,筛选DEGs并进行GO-KEGG pathway功能富集分析,结果显示表达上调的DEGs功能主要富集于细胞黏附。以上结果表明AST可能通过增加细胞间黏附促进OPC增殖,细胞间连接、细胞黏附在OPC的信号传递中起着不可替代的作用。第二部分:AST通过ITGB4介导的细胞黏附促进OPC增殖本部分利用DAVID功能注释聚类,再次印证细胞黏附因素的显著变化;同时发现ITGB4表达显著上调并且同时参与三条细胞黏附相关的通路。推测ITGB4可能是AST调节OPC细胞黏附功能并且促进OPC增殖的一个关键靶点;因此,在直接接触式共培养条件下敲低ITGB4,并利用EdU和流式细胞术检测OPC的增殖能力的变化。主要结果如下:1、GO和KEGG功能注释聚类分析发现与细胞黏附相关的三条通路被显著聚集;ITGB4(Gene ID:25724)表达显著上调,同时参与这三条细胞黏附相关通路,因此可能是促进OPC黏附功能和增殖的一个关键靶点。2、siRNA敲低ITGB4后,qPCR和Western blot结果显示ITGB4基因与蛋白表达明显下降(p<0.001);OPC细胞数量和新生细胞的比例均显著减少(p<0.001);OPC细胞周期被阻滞于G1期(p<0.001),增殖能力降低。以上结果说明,AST可以通过上调ITGB4的表达增强细胞间黏附,从而促进OPC的增殖。第三部分:AST通过ITGB4介导的细胞黏附促进OPC外泌体分泌及增殖本部分我们进一步对DEGs进行GO细胞组分富集分析,结果显示20%的DEGs被富集于GO:0070062~extracellular exosome,与NTA验证结果同时表明AST-OPC组OPC的外泌体分泌量显著增加;AST-OPC组培养条件下敲低ITGB4后,NTA和Western blot检测结果表明细胞培养上清中外泌体的分泌量显著降低;而在敲低ITGB4后补充外泌体,则可以缓解ITGB4敲低对OPC增殖的抑制作用。主要结果如下:1、GO细胞组分(Cellular Component)功能富集分析显示20%的差异基因被富集于GO:0070062~extracellular exosome,结果表明AST-OPC组中OPC外分泌相关基因的表达差异显著;NTA验证两组培养上清中的外泌体浓度,结果显示AST-OPC组培养上清中的外泌体浓度显著增加(p<0.0001)。2、siRNA敲低ITGB4后,NTA检测结果表明培养上清中外泌体的浓度显著降低(p<0.0001);Western blot检测外泌体标记蛋白Alix和外泌体所运载ITGB4的含量,结果显示这两种蛋白在细胞培养上清中的含量均显著降低(p<0.05)。3、在siRNA敲低ITGB4组补充外泌体后,外泌体摄取实验结果显示外泌体可以被细胞所摄取;NTA验证表明培养上清中外泌体的浓度确实有提升(p<0.0001);Western blot检测外泌体标记蛋白Alix和外泌体所运载ITGB4的含量,结果显示细胞培养上清中这两种蛋白的含量均有所增加(p<0.05)。4、在siRNA敲低ITGB4组补充外泌体后,EdU结果显示新生细胞的比例显著增加(p<0.01),流式细胞周期显示处于S期OPC的比例增加(p<0.01)。以上结果说明,AST可以通过ITGB4促进OPC分泌外泌体,从而促进OPC增殖。