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研究背景:病毒是中枢神经系统感染的主要病原体之一,根据流行病学统计,全世界病毒性神经系统感染的每年发病率为3.5-7.4/10万人,其临床表现主要为脑膜炎、脑炎、脊髓炎等,病原学诊断不及时可能导致死亡及后遗症的发生。病毒性神经系统感染常见诊断的方法有病毒的分离及特异性抗体检测等,前者耗时较长,后者特异性差且不能分辨既往感染和现症感染,并且两者灵敏性有限,不能满足临床需要。分子生物学检测技术如荧光定量PCR、多重PCR,LAMP技术(环介导的等温扩增)等大大提高了病毒性神经系统感染的检出率,但是,由于神经系统感染患者脑脊液中的病毒DNA含量较低导致漏检的情况并不少见,因此有必要建立一种更加高敏、快速、特异的检测方法。研究目的:建立一种随机扩增多态性技术(RAPD)联合荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)高敏定量检测单纯疱疹病毒(HSV),人类巨细胞病毒(HCMV),水痘带状疱疹病毒(VZV)新方法。研究方法:根据国内外文献筛选并设计数十条随机引物,分别对单纯疱疹病毒,人类巨细胞病毒,水痘带状疱疹病毒进行随机多态性扩增。产物经2%琼脂糖凝胶电泳,选取稳定清晰条带进行分离,纯化及克隆测序,所得序列在NCBI上应用blast-nr 比对genebank现有病毒序列,选取与HSV、HCMV、VZV匹配度高于99%的基因序列作为目的片段,并在其内部用primer3.0设计特异性内引物,以RAPD产物为模板进行荧光定量PCR,优化反应条件,建立RAPD-qPCR检测疱疹病毒新方法,并以10倍倍比梯度稀释的HSV、HCMV、VZV DNA为模板进行qPCR和RAPD-qPCR对比分析,分析此方法的灵敏性和特异性。用此方法检测55例临床诊断为病毒性神经系统感染及21例非感染性神经系统疾病患者脑脊液标本,观察三种疱疹病毒HSV、HCMV和VZV检出率。研究结果:经过筛选,确定了 HSV、HCMV、VZV扩增灵敏性及特异性最好一组引物,建立的RAPD-qPCR可分别检测出1:106 HSV、1:105 HCMV和1:105 VZVDNA,而单一 qPCR 仅能检测 1:103HSV、1:102HCMV 和 1:103 VZV DNA。RAPD-qPCR相比于单一 qPCR灵敏性提高100-1000倍,RAPD-qPCR扩增大于1:105病毒DNA得到的CT值均小于22.96±0.81,与102copies/μl的标准线相距远,易于区分阴性和阳性。用乙型肝炎病毒及疱疹病毒互为对照未见非特异扩增,特异性好。应用此方法检测55例临床诊断为病毒性神经系统感染患者脑脊液,检出VZV DNA阳性8例,检出率为14.55%,HSV及HCMV未见检出。21例非感染性神经系统疾病患者脑脊液VZV、HSV、HCMV均为阴性。结论:随机扩增多态性技术联合荧光定量检测三种病毒是一种高度灵敏及特异的检测方法;初步临床应用表明:55例临床诊断为病毒性神经系统感染患者脑脊液中,检出VZVDNA阳性8例,检出率为14.55%,HSV及HCMVDNA未检出。