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地黄为玄参科草本植物,其根入药,是我国传统的大宗药材。由于生产中长期采用块根营养繁殖,地黄易受多种病害的侵袭,致使地黄品种退化。地黄试管块根作为一种繁殖器官,有望通过人工种子技术取代脱毒苗应用于生产实践,而且试管块根还可以为今后进一步研究块根发育和次生代谢基因调控网络提供研究模型。因此,本文开展了地黄试管块根诱导体系的优化研究,同时对试管块根中梓醇含量进行提取测定,并筛选出试管块根的RNA提取方法。主要研究结果如下: 1.以茎段为外植体,采用正交设计研究MS、蔗糖、NAA和6-BA对地黄试管块根诱导的影响。结果表明,MS、蔗糖、NAA对试管块根诱导影响显著,筛选得到茎段诱导试管块根的优化培养基为:1/4MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.15 mg·L-1+蔗糖50 g·L-1。进一步研究PP333和MeJA对试管块根诱导的影响,发现1 mg·L-1 PP333或10μmol·L-1MeJA可明显促进试管块根的发育。 2.以叶片为外植体,采用正交设计研究蔗糖、NAA和6-BA对地黄试管块根诱导的影响。结果表明,NAA对试管块根诱导影响显著,其次为6-BA和蔗糖,筛选得到叶片诱导试管块根的优化培养基为:MS+6-BA3 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+蔗糖70 g·L-1。 3.以获得的地黄试管块根为材料,经甲醇超声波萃取其中梓醇,高效液相色谱法测其含量为试管地黄鲜重的6.48%,高于大田地黄中梓醇含量。 4.用异硫氰酸胍法、皂土法、改进的SDS/酚法、CTAB法、RNAiso plus5种方法分别提取地黄试管块根RNA,计算得率,并对提取的RNA进行电泳及RT-PCR技术检测与分析。结果表明,皂土法所得的总RNA得率较高,条带清晰无弥散,完整性好无明显DNA和其他杂质污染,可以满足后续分子生物学分析的需要。