【摘 要】
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脓毒血症(sepsis)和脓毒性休克(septic shock)是重危病人最常见的致死原因之一,到目前为止尚无有效的治疗手段,而LPS(lipopolysaccharide),即内毒素(endotoxin),是革兰阴性细
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脓毒血症(sepsis)和脓毒性休克(septic shock)是重危病人最常见的致死原因之一,到目前为止尚无有效的治疗手段,而LPS(lipopolysaccharide),即内毒素(endotoxin),是革兰阴性细菌所致脓毒血症的主要致病因素之一。因此从LPS信号转导途径入手寻找内毒素脓毒症治疗靶点一直是内毒素脓毒症研究的重要课题之一,相关研究尽管已经取得了许多重要进展,但治疗内毒素脓毒症仍未有实质性成果。近年来内毒素细胞内髓样分化蛋白(myeloid dfferentiation protein88,MyD88)非依赖途径的发现立即成为当前内毒素炎症反应的研究热点,并为寻找内毒素脓毒症治疗靶点提供了新思路。最近的研究证实,干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3, IRF-3)是MyD88非依赖途径信号转导通路中的关键分子之一,IRF-3基因敲除小鼠对内毒素具有明显的抗性。在MyD88非依赖途径中,虽然IRF-3信号转导通路上游已发现了一些重要的信号分子,如TRIF,TRAM,TBK1,IKKε等,但对该通路的了解还非常有限。为了进一步研究LPS激活IRF-3信号转导通路的分子调控机制,本研究对由IRF-3调控的主要靶基因IFN-β(interferonβ)启动子区域及IRF-3调控位点进行了分析,并构建了IRF-3的EGFP(enhanced green fluorescence protein)和Luciferase报告基因载体。本研究涉及的主要原理: IRF-3通过其N端DNA结合域(DNA binding domain,DBD)结合IFN-β基因启动子上游的调控序列,即IFN刺激应答组件(IFN stimulated response element,ISRE),从而直接调控IFN-β的表达。许多研究已证明,LPS由TLR4(toll like receptor 4)介导并经由IRF-3诱导IFN-β的表达。由此为切入点我们可以应用报告基因的技术平台研究LPS激活IRF-3信号转导通路的调控机制,为探讨新的治疗途径奠定基础。本研究的主要内容和结果:1.无启动子EGFP报告基因的构建:以质粒pEGFP-N2为模版扩增EGFP片段,用于替换pGL3-basic(无启动子也无增强子质粒载体)、pGL3-enhancer(无启动子但含有增强子质粒载体)和pGL3-control(有启动子也有增强子的阳性对照质粒)中原有的Luciferase基因,构建相应的EGFP报告基因载体。将构建的EGFP报告基因载体经转
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