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香兰素(Vanillin,Vin)是食品、日化等工业中应用最广泛的香料之一,还可作为保鲜剂及医药等工业的原材料,需求量很大。香兰素目前主要由化学方法制备,但化学法污染严重,且产品对人体可能有毒副作用,随着生活水平的提高,人们越来越关注健康和营养,因此对天然香兰素的需求量也越来越大。天然香兰素可以从香荚兰的花荚中提取,但由于香荚兰栽培需要人工授粉,难以扩大种植规模,这样得到的香兰素量少而价高,不能满足日益增长的需求,这促使研究人员寻找生产天然香兰素的替代方法。微生物转化法生产香兰素的方法符合欧洲立法机构对天然香兰素的要求,而且微生物种类繁多,适应性极强,使该法具有很大的发展前景。
考虑到技术可行性和经济性,本课题设计了以阿魏酸为原料,利用基因工程菌,通过辅酶A的去乙酰反应途径二步合成香兰素的方案。
第一步是通过阿魏酰辅酶A合成酶(Fcs)、烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶(Ech)和香兰素脱氢酶(Vdh)把阿魏酸转化成香草酸,
第二步把香草酸还原为香兰素。二步法利用Vdh能迅速将香兰素转化为毒性相对较低的香草酸的特点从而将克服采用一步法时由于香兰素化学活性很高而且对微生物有较大的毒性,导致香兰素得率很低的问题。
本论文克隆了实验室保藏的荧光假单胞菌的阿魏酰辅酶A合成酶基因和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因,并对他们进行了表达和功能验证,取得以下成果：
1.从实验室保藏的一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens ATCC13525)成功地克隆出了阿魏酰辅酶A合成酶基因fcs和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因ech。
2.将克隆得到的fcs基因和ech基因成功地在重组大肠杆菌中进行了表达,并验证了重组蛋白的活性,酶活力测定值分别为0.1863U/mg和0.3199U/mg。
3.将fcs和ech基因通过连接肽连接,得到融合表达基因ech-GS-fcs。
这样就为利用廉价的碳源通过两步法合成天然香兰素打下了坚实的基础,从而开辟了生物合成香兰素的新途径。