论文部分内容阅读
研究背景:三阴乳腺癌(TNBC)是指ER、PR和HER-2均为阴性的乳腺癌,占所有乳腺癌的15-24%,对常规治疗的反应不佳,因缺乏相应靶点也无法从靶向治疗及内分泌治疗中获益,其早期复发、转移率高,预后差而成为乳腺癌治疗中最为棘手的类型。近年来抗体靶向免疫治疗中的单克隆抗体治疗如曲妥珠单抗在HER-2过表达的乳腺癌患者中的成功应用,也为TNBC的治疗提供了新的思路。近年来出现了一些针对TNBC靶向治疗如PARP抑制剂、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂、抗血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、m TOR抑制剂及TRAIL诱导剂等,但临床资料显示仅有少部分TNBC从中获益,其在临床应用的效价及安全性尚需长期的评估,人们一直致力于寻找更好的靶点。许多研究显示,肿瘤细胞包括乳腺癌细胞表面高表达BGA前体物质H抗原,经血型抗原糖基转移酶糖基化作用,H抗原可转变成血型抗原(A或B抗原)。BGA与肿瘤的恶性程度密切相关,可以影响肿瘤细胞的分化、增殖、转移等生物学特性。同时BGA是一类具有很强的免疫原性和抗原性的同种异型抗原,可被血型抗体识别并激活CDC和ADCC,例如临床上血型不合输血时会发的溶血反应。此外,乳腺患者体内的微环境多处于免疫抑制状态,APC不能有效的将肿瘤抗原递呈给免疫系统,而血型抗原是天然抗原,可直接被血型抗体识别。可否利用BGA的这些特点,使之成为TNBC治疗的靶点是我们关注的重点。研究目的:本研究中从构建BGA高表达的三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞系入手,初步研究血型抗体对转染后MDA-MB-231细胞的抗肿瘤效应。同时观察BGA对MDA-MB-231细胞的生物学行为的影响,并进一步探讨其发生机制,为BGA在TNBC治疗中的应用提供理论基础。研究方法:1.利用慢病毒转染方法,建立BGA稳定转染且高表达的MDA-MB-231细胞系。2.应用流式细胞术检测转染前后MDA-MB-231细胞表面BGA表达、细胞周期的变及同型血浆处理前后MDA-MB-231细胞的凋亡。3.应用WST-1增殖抑制实验检测同型血浆、不同浓度5-FU及不同效靶比NK细胞对MDA-MB-231细胞增殖的影响。4.应用划痕致伤实验、成球实验检测转染前后MDA-MB-231细胞侵袭转移能力及克隆形成能力的变化。5.应用ELISA方法检测转染前后MDA-MB-231细胞ATP及HMGB1的水平,探讨细胞是否发生免疫原性死亡。6.用Western blot方法检测转染前后MDA-MB-231的细胞周期相关蛋白及调控蛋白、整合素相关信号通路中相关蛋白水平的改变,进行相关机制的研究。研究结果:1.应用慢病毒转染方法将血型抗原A糖基转移酶转染入三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞系,经流式细胞术检测证实细胞转染后高表达血型抗原A。2.转染后MDA-MB-231细胞的增殖能力、侵袭转移能力降低,克隆形成能力下降。3.转染后MDA-MB-231细胞周期S期比例明显增高,与5-FU合用可发生协同抗肿瘤作用。4.转染后MDA-MB-231细胞ATP及HMGB1的释放增多。5.在B型血浆作用下,转染后MDA-MB-231细胞增殖和侵袭转移能力明显下降,凋亡增加。6.转染后MDA-MB-231细胞整合素下游FAK介导的ERK1/2及PI3K通路被抑制,p-p38MAPK增高。研究结论:1.B型血浆可以通过介导CDC及ADCC效应对血型抗原A高表达MDA-MB-231细胞发挥抗肿瘤作用。2.血型抗原A糖基转移酶通过抑制“整合素-FAK”信号通路使MDA-MB-231细胞增殖、侵袭、转移、克隆形成能力下降。3.血型抗原A糖基转移酶诱导细胞发生S期同步化,并显著增加了5-FU的化疗敏感性。4.血型抗原A糖基转移酶通过诱导细胞发生ICD而提高MDA-MB-231的免疫原性。