胶质母细胞瘤(Glioblastoma, WHO Ⅳ级),或称多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme, GBM),是中枢神经系统最常见和恶性程度最高的肿瘤。胶质母细胞瘤的治疗一直是困扰神经外科学的难题,目前临床的首选治疗方案是最大程度的手术切除,术后辅以放疗、化疗等。近些年来,胶质母细胞瘤的诊断及治疗方面取得了诸多进展,但因其恶性程度高,术后易复发,预后仍然极差。因此,探索胶质母细胞瘤的发病机制及寻找更为有效的治疗方法便成为目前的一大研究热点。随着分子生物学和分子遗传学的发展,人们对胶质母细胞瘤发病机制和诊断治疗的研究已进入基因水平。越来越多的研究发现,某些基因、受体、信号转导通路和信号调节分子等与胶质母细胞瘤的发生及发展有着密切联系,这为寻找胶质母细胞瘤治疗的新方案——分子靶向治疗提供了可能。胶质母细胞瘤具有高增殖性和高侵袭性,这些生物学特性便成为研究胶质母细胞瘤靶向治疗的突破口。本研究是山东大学医学院人体解剖与组织胚胎学教研室与美国康奈尔大学威尔医学院TMHRI研究中心系统医学与生物工程部(Department of Systems Medicine and Bioengineering, TMHRI, Weill Cornell Medical College)的合作研究项目,旨在大规模筛选及探寻新的胶质母细胞瘤分子靶向治疗的候选药物,并进一步研究阐明其作用机制,为胶质母细胞瘤的分子靶向治疗提供理论依据。本研究分两个部分进行：第一部分抑制胶质母细胞瘤细胞生长和侵袭的小分子化合物的高通量筛选目的：对LOPAC1280TM化合物库(Library of Pharmacologically Active Compounds)中的56类,共1,280种具有药理活性的小分子化合物进行高通量筛选,评估这些化合物对U87-Luc(表达荧光素酶的人胶质母细胞瘤细胞)生长和侵袭的抑制作用,以探寻对胶质母细胞瘤可能具有治疗作用的化合物。方法：我们的合作实验室(TMHRI, Weill Cornell Medical College)之前已成功建立了一套基于荧光(Bioluminescence-based)的高通量筛选(high-throughput screening, HTS)技术体系,可以同时、批量的检测不同化合物对胶质母细胞瘤细胞U87-Luc的生长和侵袭这两种生物学行为的影响。在本部分研究中,我们利用这一技术制备筛选培养板,这些筛选培养板中含有LOPAC1280TM化合物库中各化合物的溶胶混合物；将筛选培养板置入37℃、5%CO2细胞培养箱中静置2h,将U87-Luc细胞和荧光素共同接种于筛选培养板上半部分(间接检测每孔细胞总数),将U87-Luc细胞单独接种于筛选培养板下半部分(间接检测每孔内发生侵袭的细胞数)；通过荧光成像(Bioluminescence Imaging, BLI)的方法,检测0h和各化合物处理24h后,每孔内的细胞总数和发生侵袭的细胞数,评估各化合物对人胶质母细胞瘤细胞U87-Luc生长和侵袭的抑制作用。本研究选用高通量筛选普遍采用的统计学参数Z’因子(Z’ factor)来检测筛选可信度。Z’因子的计算方法为：1-(3σs+3σb)/|μs-μb|,该公式中σ代表信号(σs)或背景(σb)的标准差(SD),μ代表信号(μs)或背景(μb)的平均值(mean)。若Z’因子等于1,则认为这个筛选方法是完美的；若Z’因子在0.5到1.0之间,则认为该筛选方法是优秀的；若Z’因子小于0.5,则认为该筛选方法不够可信。数据由GraphPad Prism for Windows统计软件处理。计量资料统计结果以均值±标准误(mean±SEM)表示。多组样本均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),随后采用Dunnett’s post hoc test进行组间两两比较。P<0.05时认为差异有统计学意义。结果：LOPAC1280TM化合物库高通量筛选的平均Z’因子为0.513,表明本筛选技术可靠,实验结果可信,可用来进行以细胞为基础的高通量筛选(cell-based high-throughput screening)。通过LOPAC1280TM化合物库的高通量筛选,我们共得到25种可能抑制胶质母细胞瘤细胞生长和侵袭的化合物,它们分属于LOPAC1280TM化合物库的不同种类,其中包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR, erbB1)和人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER2, erbB2)的酪氨酸激酶抑制剂GW2974。此外,其他24种中至少有6种已被报道可抑制胶质母细胞瘤细胞的生长或侵袭,这些化合物已被基础实验证实、或正在进行临床试验、或已经用于胶质母细胞瘤的临床治疗,这一发现进一步证明了我们的筛选的可信性。结论：通过对LOPAC1280TM化合物库中1,280个化合物进行高通量筛选,发现25种可能抑制人胶质母细胞瘤细胞U87-Luc增殖和侵袭的化合物,其中包括EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂GW2974。意义：LOPAC1280TM化合物库共包含56类,共1,280种具有药理活性的化合物,其范围覆盖细胞信号转导和神经科学领域,包含药物研发领域常用的药物种类和绝大多数药物筛选靶点,因此,从中探寻特异性抑制胶质母细胞瘤细胞生长和侵袭的化合物,不仅会为胶质母细胞瘤的分子靶向治疗提供理论依据,而且有助于阐明胶质母细胞瘤发生及发展的分子机制。筛选结果中包含EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制齐(?)GW2974(LOPAC No. G0668)。以往研究表明,EGFR和HER2在胶质母细胞瘤中常有表达,并且对细胞的一系列生物学行为具有重要的调控作用。同时,已有研究证实GW2974对多种肿瘤模型如胆囊癌、乳腺癌和头颈部鳞癌等有一定的治疗作用。因此,GW2974有可能成为靶向治疗胶质母细胞瘤的候选药物,我们在第二部分系统的研究了其对胶质母细胞瘤的作用及机制。除GW2974以外,其他24种化合物也可能对胶质母细胞瘤有治疗作用,我们也将(或正在)对它们做进一步研究,目前已取得部分成果。第二部分GW2974对胶质母细胞瘤作用的离体及在体研究目的：从第一部分的高通量筛选结果中选择EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂GW2974作为主要研究对象,从离体、在体两个方面,较为系统的研究其对胶质母细胞瘤生长和侵袭等方面的作用,并进一步揭示其可能的作用机制。方法：1.离体实验实验分组为：对照组、低剂量GW2974组和高剂量GW2974组。离体培养人胶质母细胞瘤细胞系U87MG、U251MG和U87-Luc。用含不同浓度() GW2974的细胞培养液培养U87MG和U251MG细胞24h,通过MTS实验检测细胞活性,以确定离体实验中合适的GW2974剂量。根据MTS实验结果,确定各实验组的相应处理为：对照组(无处理)低剂量GW2974组(0.5μM GW2974处理)和高剂量GW2974组(5μM GW2974处理)。按照组别用含不同浓度GW2974(?)的细胞培养液培养U87MG和U251MG细胞24h,并通过BrdU标记实验检测细胞增殖情况、通过BioCoatTM MatrigelTM基质胶细胞侵袭实验检测细胞侵袭情况、通过Wound-healing划痕实验检测细胞迁移情况,对结果进行统计学分析,揭示离体水平GW2974对人胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响。2.在体实验用离体培养的人胶质母细胞瘤细胞系U87-Luc建立胶质母细胞瘤脑荷瘤鼠模型。根据以往GW2974在小鼠模型中的研究数据确定合适的给药剂量(30mg/kg/day(?)(?)100mg/kg/day)。本部分实验分组与离体实验部分相同,具体组别及相对应的处理如下：对照组(灌胃给予GW2974的溶剂CD10)、低剂量GW2974组(灌胃给予30mg/kg/day GW2974)、高剂量GW2974组(灌胃给予100mg/kg/day GW2974)。荷瘤鼠模型建立日为在体实验的第0天,相应处理自第1天起,每日一次,直至荷瘤鼠死亡。我们共建立了45只胶质母细胞瘤脑荷瘤鼠模型,同时进行两个并行的动物实验(肿瘤生长监测及荷瘤鼠生存期观察实验；荷瘤鼠脑肿瘤组织学检查实验)。对于肿瘤生长检测及荷瘤鼠生存期观察实验,将30只荷瘤鼠按实验组别随机分入3组(每组10只),给予相应的处理,每周用IVIS(?)非侵入式活体分子影像系统(Xenogen IVIS(?) Imaging System)检测肿瘤生长情况,最后记录脑荷瘤鼠生存期。对于荷瘤鼠脑肿瘤组织学检查实验,将15只荷瘤鼠按实验组别随机分入3组(每组5只),给予相应的处理。在第14天处死全部荷瘤鼠,收集脑组织进行固定、石蜡包埋及切片。通过苏木精和伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色检测瘤组织病理学特征,通过CD34免疫组化染色检测瘤组织新生血管形成状况,通过侵袭标志物fascin蛋白的免疫组化染色评估瘤组织的侵袭情况。对在体实验结果进行统计学处理和比较分析,评估GW2974对人胶质母细胞瘤肿瘤生长、侵袭、血管形成和荷瘤鼠生存期等方面的影响。3.机制研究相关实验首先将离体培养的人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251MG根据组别进行相应处理,实验分组及药物处理同离体实验部分。然后提取各组蛋白,通过抗体芯片技术(Panorama(?) Antibody Array-XPRESS Profiler725)比较各处理组与对照组之间与各信号转导通路相关的725种蛋白的表达,得到差异性表达蛋白(differentially expressed proteins)。继而利用IPA通路分析系统(Ingenuity(?) Pathway Analysis Systems)分析差异性表达蛋白,得到可能受影响的信号转导通路,并通过Western blot验证上述通路的关键蛋白表达水平,揭示GW2974的作用机制。最后根据结果进行相关的细胞行为学检测,对所得作用机制进行验证。4.统计学分析数据由GraphPad Prism for Windows统计软件处理。当p<0.05时认为差异有统计学意义。首先对所得数据进行D’Agostino and Pearson omnibus正态性分布检验(D’Agostino and Pearson omnibus normality test)。对于正态性分布的数据资料,组间两两比较用Student’s t test,或单因素方差分析及随后的Tukey’s test (one way ANOVA followed by Tukey’s test)统计结果以均值±标准误(mean±SEM)表示；对于样本量小或非正态性分布的数据资料,组间比较用Wilcoxon rank-sum test检验,统计结果以中位数(：median)及范围(range)表示。脑荷瘤鼠的生存分析采用Kaplan-Meier法,用Log-rank test比较组间差异。结果：1.离体实验结果通过MTS实验检测GW2974对胶质母细胞瘤细胞活性的影响。结果显示GW2974可抑制细胞活性,该作用随剂量升高而增加；当GW2974的剂量达到或高于10μM时,出现明显的细胞毒性。其中,0.5μM和5μM GW2974处理24h后,U87MG细胞活性分别降为对照组的89.4.%和86.3%(p<0.05),U251MG细胞活性分别降为对照组的92.2%和88.0%(p<0.05)。根据MTS实验结果,选取0.5μM和5μM两个剂量,来研究不同剂量GW2974对胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭等方面的作用。通过BrdU标记实验检测GW2974对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响。结果显示,对照组U87MG细胞的BrdU阳性率为47.7%,与其相比,低剂量GW2974组U87MG细胞的BrdU阳性率降为40.3%(p<0.05),高剂量GW2974组U87MG细胞的BrdU阳性率降为39.3%(p<0.05)。U251MG细胞出现类似的结果,即对照组BrdU阳性率为42.7%,与其相比,低剂量GW2974组及高剂量GW2974组的BrdU阳性率分别降为35.7%和32.1%(p<0.05)通过BioCoatTM MatrigelTM基质胶细胞侵袭实验检测(?)GW2974对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的影响。结果显示,低剂量GW2974组U87MG和U251MG的细胞侵袭分别降为对照组(100%)的55.6%和48.6%(p<0.05),高剂量GW2974组U87MG和U251MG的细胞侵袭无显著性变化。Wound-healing划痕试验检测GW2974对胶质母细胞瘤细胞迁移的作用,结果显示,低剂量GW2974组U87MG和U251MG细胞的相对迁移距离分别降为其正常对照组(100%)的42.5%和51.6%(p<0.05)。高剂量GW2974组U87MG和U251MG的细胞迁移无显著性变化。2.在体实验结果荷瘤鼠肿瘤生长检测实验结果显示,在第14天,低剂量GW2974组和高剂量GW2974组荷瘤鼠的脑肿瘤生长均比对照组显著降低(p<0.05),在第21天这种降低更明显(p<0.01)荷瘤鼠生存期观察实验结果显示,对照组所有荷瘤鼠在第22天时已全部死亡；低剂量GW2974组的荷瘤鼠在第27天时依然100%存活；高剂量GW2974组从第20天起出现脑荷瘤鼠死亡,至第23天荷瘤鼠全部死亡。用Kaplan-Meier法进行生存分析,Log-rank test比较组间差异,结果表明,低剂量GW2974显著延长胶质母细胞瘤荷瘤鼠生存期(p<0.01),而高剂量GW2974对荷瘤鼠生存期无明显影响。荷瘤鼠脑切片H&E染色结果显示：与对照组相比,低剂量GW2974组荷瘤鼠脑肿瘤边界较为规则,提示肿瘤侵袭受到抑制；而高剂量GW2974组肿瘤边界不规则,肿瘤组织向周围脑组织浸润。对脑切片进行免疫组化染色,检测肿瘤侵袭标志物Fascin蛋白在荷瘤鼠脑肿瘤中的表达,并进行半定量评分及统计学分析,结果显示：低剂量GW2974组的肿瘤侵袭性较对照组显著降低(p<0.05)；高剂量GW2974组与对照组之间无显著性差异。CD34免疫组化染色结果显示：低剂量和高剂量GW2974均显著降低肿瘤部位的微血管密度(microvessel density, MVD)(p<0.05),提示肿瘤血管生成受到抑制。3.机制研究相关实验结果为了研究不同剂量GW2974影响胶质母细胞瘤侵袭的作用机制,我们利用抗体芯片技术,分析不同剂量GW2974处理的胶质母细胞瘤细胞中与多个通路相关的725种蛋白的表达水平变化,并利用IPA通路分析系统分析差异性表达蛋白,得到不同剂量GW2974可能影响的不同信号转导通路,然而将有显著性变化的部分通路中的关键蛋白通过Western blot进行验证,从而阐明不同剂量GW2974对胶质母细胞瘤细胞作用不同的可能机制。结果显示,与对照组相比,高剂量和低剂量GW2974组中磷酸化EGFR (phospho-EGFR, p-EGFR)和磷酸化ERK (phospho-ERK, p-ERK)的表达均降低(p<0.05),而与此不同的是,磷酸化p38(phospho-p38, p-p38)在低剂量GW2974组表达水平不变,而在高剂量GW2974中表达水平增高(p<0.05)。这一结果提示,p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路可能是不同剂量GW2974对胶质母细胞瘤不同作用的关键点之一。为了验证p38MAPK通路在GW2974调控胶质母细胞瘤侵袭这一过程中所起的作用,我们用p38特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK通路后再对GW2974的作用进行研究,即为每个实验组(对照组、低剂量GW2974组和高剂量GW2974组)均设一个p38特异性抑制剂对照组。结果显示,阻断p38MAPK通路后,高剂量GW2974组的胶质母细胞瘤细胞不再表现出较强的侵袭能力,或者说,p38MAPK通路的阻断恢复了高剂量GW2974对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的抑制。这一结果提示,高剂量GW2974组比低剂量GW2974组增强的细胞侵袭能力可能是由p38MAPK通路的激活引起的,或者说,p38MAPK通路可能是胶质母细胞瘤细胞对高剂量GW2974产生耐受的一个机制。结论：1.低剂量GW2974可抑制胶质母细胞瘤细胞的活性、增殖、侵袭和迁移能力；可抑制荷瘤鼠脑内移植瘤的生长、侵袭及血管生成,延长荷瘤鼠生存期。高剂量GW2974可抑制胶质母细胞瘤的细胞活性和增殖,但不能抑制细胞的侵袭和迁移能力；可抑制荷瘤鼠脑内移植瘤的生长和血管生成,但并不能抑制肿瘤侵袭,也无法延长荷瘤鼠生存期。2.GW2974对胶质母细胞瘤侵袭的作用与剂量有关,剂量不同可导致GW2974对胶质母细胞瘤治疗效果的不同。3.高剂量GW2974处理组比低剂量GW2974处理组增强的细胞侵袭可能是由p38MAPK通路激活引起的,p38MAPK通路可能是胶质母细胞瘤细胞对高剂量GW2974产生耐受的机制之一。本研究的意义：鉴于EGFR和HER2在胶质母细胞瘤中的表达和在细胞生物学行为方面的调控作用,以及GW2974在胶质母细胞瘤研究中的缺乏,我们在本次研究中选取GW2974做为研究对象,首次从离体、在体两方面较系统的评估了GW2974对胶质母细胞瘤增殖和侵袭等方面的作用。GW2974对肿瘤生长的抑制作用已有报道,通过本研究,我们首次发现该化合物对胶质母细胞瘤细胞的侵袭的抑制作用取决于合适的剂量。这一研究结果提示我们,在胶质母细胞瘤的靶向治疗中,选择合适的给药剂量非常关键,它有可能直接影响肿瘤细胞对药物的反应,决定药物治疗的效果。此外,我们的研究结果或许有助于解释之前针对EGFR(?)(?)EGFR/HER2的靶向治疗在胶质母细胞瘤中大多失败的原因。