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莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)作为一种能够侵染多种鳞翅目夜蛾科害虫的昆虫病原真菌,能在田间引发夜蛾科害虫的流行病故而受到人们的高度重视。但是莱氏野村菌作为杀虫的主要有效成分--分生孢子发酵生产所需的条件较为苛刻,从而限制了其规模化生产及大规模应用。重庆大学王中康的科研团队借鉴植物病原真菌微菌核的诱导方法,成功诱导培养出能代替能传统分生孢子的侵染体结构,即易于规模化生产、耐高温、耐储存、抗逆性强等优点的莱氏野村菌微菌核,并采用比较转录组的方法从分子生物学方面探索了莱氏野村菌微菌核的形成机理。研究发现,在优化诱导培养基(AM)时发现添加不同浓度Ca2+能显著影响微菌核的产量。因此,本论文从莱氏野村菌比较转录组中选取与钙调控相关的钠钙交换体(NCX)与钙离子通道抑制子(CCI)基因研究钙与莱氏野村菌产生微菌核的关系。主要研究结果如下:①通过在莱氏野村菌微菌核AM培养基中不添加Ca2+发现:不添加Ca2+的AM培养基中菌丝团大小不均一,菌丝团数量减少了34.4%,且菌丝缠绕疏松,边缘松散并有菌丝飘散,紫褐色色素积累明显降低;但统计生物量发现Ca2+添加与否对发酵生物量没有明显影响;②根据比较转录组NCX和CCI的EST序列,利用普通PCR方法获得NCX和CCI的c DNA全长序列和基因组序列,其开放阅读框(ORF)分别为3006bp和405bp,各自编码1001和134个氨基酸。利用生物信息学软件和网站分析NCX和CCI发现:NCX编码蛋白的分子量为109.563k Da,主要由α螺旋和随机卷曲组成,理论等电点为5.98,无信号肽,但有跨膜结构域;CCI编码蛋白的分子量为13.63k Da,主要由α螺旋、β折叠和随机卷曲组成,理论等电点为7.5,无跨膜结构域,但有信号肽,其信号肽为1-16个氨基酸。利用Clustal X和MEGA4.0同源比对和系统进化分析发现莱氏野村菌NCX和CCI蛋白与绿僵菌的亲缘关系最近。③实时荧光定量PCR(q PCR)分析NCX和CCI的表达模式发现:NCX和CCI在微菌核形成的各个时期均有表达,其中NCX的表达量在微菌核形成初期显著性的增高(48-72h),在72h时达最大,然后在微菌核成熟过程(72-120h)中其表达量又逐渐降低;CCI的表达量在微菌核发育期(48-120h)表达量逐渐增高,在120h时达到最大。这说明NCX与CCI均参与了微菌核的形成,但二者参与的调控有差异,NCX主要在微菌核形成初期起作用,参与微菌核形成的启动及发育过程,而CCI主要在微菌核成熟末期高表达,可能参与微菌核成熟过程。④利用RNA干扰技术(RNAi)研究了NCX和CCI功能:通过筛选发现NCX和CCI的最适干扰浓度均为400n M,干扰效率分别为55.5%、93.6%。对基因的表达检测发现,干扰NCX基因后,CCI的表达量上升了2.1倍;干扰CCI基因后NCX的表达量上升了5.3倍;在固体培养基上,NCX和CCI干扰菌株相对于野生型(WT)和阴性对照(EGFP)的菌落形态变小,产孢时间延迟,且产孢量分别减少为60.6%和88.2%。在微菌核液体诱导培养基AM中,NCX和CCI干扰菌株微菌核的形态和大小不均匀,AM培养液的黏稠度明显降低,无紫褐色色素积累。统计分析微菌核的产量发现干扰菌株所形成微菌核数量急剧减少,与对照菌株相比,分别减少了81.8和90.4%。同时统计培养液中的生物量,发现NCX和CCI干扰菌株的生物量分别降低25.8%和30.5%。⑤采用点滴接种法接种发酵产生的微菌核到三龄斜纹夜蛾幼虫表皮上,测定NCX和CCI对各菌株的毒力的影响:结果显示,干扰菌株对斜纹夜蛾幼虫的致死率比对照菌株分别下降4.45%、6.1%,LT50都延长了2d以上。结论:莱氏野村菌NCX和CCI基因都参与了微菌核形成,其中NCX主要参与微菌核形成的启动及微菌核发育过程,CCI基因主要参与微菌核成熟过程;NCX和CCI基因不仅严重影响微菌核的形成,而且对莱氏野村菌分生孢子产生及菌株毒力也有明显影响,但其影响机理还需要进一步研究。