肝细胞肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是导致HCC发生发展的重要原因。乙肝病毒基因组中x基因表达的X蛋白(HBx)具有反式激活作用，通过调节多种癌基因的表达，影响多种信号途径，进而促进HCC的发生发展，但其致癌的分子机制仍不清楚。为了进一步深入揭示HBx致癌的分子机制，本论文从以下三个方面进行了研究:　　第一部分:HBx通过Lin28A促进肝癌细胞增殖的作用及分子机制的研究　　Lin28A是一个重要的诱导性多功能干细胞(iPS)因子，参与多种癌症的发生发展。但是，Lin28A与肝癌的关系迄今未见报道。为此，提出科学假设:“HBx可能通过Lin28A促进肝癌细胞的增殖”。为了探讨Lin28A与肝癌的关系，首先检测了Lin28A在临床肝癌标本中的表达情况。免疫组化和实时定量PCR(qRT-PCR)研究结果显示，Lin28A在临床肝癌组织中的表达水平显著高于其癌旁组织，有趣的是HBx与Lin28A的表达呈正相关，提示HBx可能具有上调Lin28A的作用。进一步研究结果显示，Lin28A在整合HBV全基因组的HepG2.2.15、瞬时或稳定表达HBx、瞬时转染HBV的肝癌细胞系HepG2/H7402细胞和p21-HBx转基因鼠肝癌组织中均呈上调表达。然后，对HBx上调Lin28A的分子机制进行了详细的探讨。通过报告基因实验，发现Lin28A启动子的核心区域位于-643-+375，HBx对该区域具有激活作用。进一步应用生物信息学分析，发现HBx调节的区域-235--66存在转录因子Sp-1结合位点，提示HBx可能通过反式激活转录因子Sp-1实现对Lin28A启动子的激活作用。应用报告基因、qRT-PCR、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和电泳迁移率实验等进行研究，结果显示HBx可与Sp-1结合，进而激活Lin28A的启动子，上调Lin28A的表达。在上述研究基础上，对HBx是否通过Lin28A促进肝癌细胞增殖进行了探讨。应用EdU掺入实验、MTT实验和克隆形成实验等方法检测，结果显示干扰Lin28A的mRNA能够明显阻断HBx促进肝癌细胞增殖的作用。裸鼠成瘤实验结果显示，抑制Lin28A的表达能够明显抑制HepG2-X的成瘤能力。上述结果表明，HBx可以通过上调Lin28A促进肝癌细胞的生长，提示Lin28A可作为肝癌治疗的靶点。　　第二部分:HBx通过Lin28B促进肝癌细胞增殖的作用及分子机制的研究　　Lin28B作为Lin28A的同源物，参与多种癌症的发生发展。文献报道显示，Lin28B与肝癌的临床预后差有密切联系，但是Lin28B在HBV相关肝癌中的作用仍不清楚。为此，提出科学假设:“HBx可能通过Lin28B促进肝癌细胞的增殖”。为了探讨Lin28B与HBV相关肝癌的关系，首先检测了Lin28B在临床肝癌及癌旁组织中的表达情况。qRT-PCR研究结果显示，Lin28B在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织。发现HBx与Lin28B的表达水平呈正相关，提示HBx可能上调Lin28B的表达。进一步的研究结果显示，Lin28B在HepG2.2.15、瞬时或稳定表达HBx、瞬时转染HBV的HepG2/H7402细胞和p21-HBx转基因鼠的肝癌组织中均呈上调表达。随后，对HBx上调Lin28B的分子机制进行了深入的探讨。应用报告基因及qRT-PCR检测发现，HBx通过转录因子c-Myc激活Lin28B的启动子上调其表达。为了进一步探讨HBx是否通过Lin28B促进肝癌细胞的增殖，在HepG2-X细胞中干扰Lin28B的表达。MTT实验结果显示，干扰Lin28B能够明显抑制HBx诱导的肝癌细胞增殖。同时，通过裸鼠成瘤实验发现，抑制Lin28B的表达能够显著降低HepG2-X的成瘤能力。因此，HBx可以通过上调Lin28B促进肝癌细胞的增殖。Lin28B在HBV感染的肝癌治疗中可能成为一个有效的靶点。　　第三部分:HBx通过Rab18促进肝癌细胞脂类代谢和增殖异常的作用及分子机制的研究　　脂类代谢异常在肝癌的发生发展中发挥了重要作用。文献报道，HBx参与肝癌细胞的脂类代谢异常。Rab18是Ras癌基因家族的重要成员之一，在脂类代谢中发挥重要的作用，但其是否参与肝癌的发生发展仍不清楚。为此，提出科学假设:“HBx可能通过Rab18促进肝癌细胞脂类代谢和增殖异常”。为了证明Rab18在肝癌中的重要性，检测了Rab18在肝癌及癌旁组织中的表达情况。免疫组化及qRT-PCR检测结果显示，Rab18在肝癌组织中高表达。有趣的是，HBx的表达水平与Rab18呈正相关，说明Rab18可能参与HBx的致癌作用。通过进一步的研究发现，在p21-HBx转基因鼠、HepG2.2.15、瞬时转染HBV、瞬时或稳定表达HBx的HepG2/H7402细胞中HBx均能够上调Rab18的表达。随后我们深入探讨了HBx上调Rab18的分子机制。在转录水平上，通过报告基因实验发现，Rab18的启动子核心区域位于-264-+85。进一步应用生物信息学分析发现，HBx的调节区域存在转录因子AP-1和CREB的结合位点。报告基因实验结果表明，HBx能够通过COX-2/5-LOX/AP-1/CREB激活Rab18的启动子活性上调其表达。在转录后水平上，通过生物信息学软件我们预测了靶向Rab18的microRNAs(miRNAs)，发现miR-429能够靶向Rab18的3UTR区域。报告基因及蛋白质免疫印迹实验结果证明了miR-429能够直接靶向Rab18并下调其表达。同时，qRT-PCR检测结果显示HBx能够抑制miR-429的表达，说明HBx通过抑制miR-429上调Rab18的表达。为了进一步探讨HBx是否通过Rab18促进肝癌细胞脂类代谢和增殖异常，在肝癌细胞中抑制或过表达Rab18。应用油红染色、MTT实验、EdU掺入实验和克隆形成实验检测发现，Rab18参与了HBx诱导的脂滴形成和细胞增殖异常。裸鼠成瘤实验结果显示，抑制Rab18的表达能降低HepG2-X的成瘤能力，当抑制HBx后可导致肝癌细胞成瘤能力下降，同时过表达Rab18能够营救上述作用。因此，HBx能够通过两条信号途径HBx/COX-2/5-LOX/AP-1/CREB/Rab18和HBx/miR-429/Rab18上调Rab18的表达，导致肝癌细胞脂类代谢和增殖的异常。　　综上所述，本研究为揭示Lin28A/Lir28B、Rab18在HBx致癌过程中的作用及其分子机制提供了新的实验依据，进一步丰富了HBx促进肝癌细胞增殖和脂类代谢异常的分子机理研究，对于肝癌的诊断、预防及治疗具有重要的理论价值。