超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简称SOD1)是生物体内一种重要的金属酶,对机体有高效的抗氧化作用。本实验主要研究仿刺参铜锌超氧化物歧化酶的功能及性质。通过生物信息学分析方法,对Aj-SOD1理论蛋白等电点及蛋白分子质量进行预测(pI=5.65,MW=15.47 kDa)。利用 MAGA 6.0 构建了 Aj-SOD1 的系统进化树。利用Swiss Model分析蛋白的三级结构,结果显示目的蛋白能够结合铜、锌离子。利用荧光定量PCR,对Aj-SOD1基因的分布表达情况进行分析。结果表明,发现Aj-SOD1在各组织都有相应的表达,但在肠和呼吸树中表达显著。实验首先对海参的体腔细胞进行离体培养,构建H202/LPS的细胞培养模型,对经H202/LPS刺激细胞的情况进行分析。结果表明,在H202/LPS刺激过程中,海参体腔细胞出现了明显凋亡损伤作用。实验同时研究了 Aj-SOD1蛋白对细胞具有一定的抗氧化作用,并对经H202/LPS刺激损伤细胞的修复功能。本实验克隆了(Aj-SOD1)cDNA全长编码序列基因。利用TRIZOL法从海参肠组织中提取总RNA,通过反转录PCR扩增获得Aj-SOD1基因的编码序列(GenBank:JX097096.1,459bp)。构建克隆载体pMD18-Aj-SOD1。在目的基因两端引入Xho I/NdeⅠ酶切位点,及His标签后,将Aj-SOD1克隆质粒与表达载体pET30a(+)分别双酶切后连接,构建重组表达载体pET30a-Aj-SOD1。将含有pET30a-SOD1重组子转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。成功构建Aj-SOD1的原核表达载体。通过IPTG诱导表达后,实验利用Ni-NTA亲和层析,获得了纯度高、可溶、具有抗氧化活性的海参SOD1蛋白。最后实验优化了蛋白表达的条件,获得了最优表达条件,温度37 ℃,诱导时间8 h,转速设置为200r/min,诱导剂浓度0.1mM。本实验对深入研究海参铜锌超氧化物歧化酶的性质具有重要作用,对海参养殖和开发同样具有重要的指导作用。