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前体m RNA的加工是大多数后生动物基因表达和发挥功能所必需的基本步骤。富含丝氨酸/精氨酸（Serine/arginine-Rich,SR）的剪接因子SR蛋白作为RNA加工过程的关键调控因子,在m RNA的剪接激活、剪接抑制、输出、稳定和翻译中发挥重要作用。SR蛋白家族有12个成员,在功能上有一定的重叠和冗余性。近年来,有关Srsf1、Srsf2、Srsf3和Srsf10基因敲除小鼠模型的研究显示,在发育过程中SR蛋白家族成员对其靶基因可变剪接的调控具有特异性。Srsf5（Serine/arginine-Rich Splicing Factor 5）是SR蛋白家族成员之一,是一种葡萄糖诱导蛋白。课题组前期实验结果显示,Srsf5在新生小鼠的心脏中高表达,并随年龄增加而减少。生物信息学分析发现,与功能正常的成人心肌细胞相比,在低射血分数且功能失调的成人心肌细胞中SRSF5低表达。推测,Srsf5是维持心脏功能的重要调控因子。然而,Srsf5在组织发育和心脏疾病中的功能尚不清楚。为了研究Srsf5在维持小鼠心脏功能中的作用及其调控机制,我们构建Srsf5基因敲除（Srsf5-/-）小鼠模型,发现Srsf5基因敲除小鼠在围产期死亡,发生心功能障碍,并表现为心室肌致密化不全性心肌病。转录组学分析发现,肌节M带的主要组成成分Myom1是Srsf5的潜在底物。Myom1是一种将肌球蛋白丝与肌节M线交联,在收缩期间保持肌节结构完整性的蛋白质,是肌肉收缩的关键调控因子之一。心脏中的Myom1在出生前后发生亚型转换,胚胎期主要表达包含18号外显子的EH-Myom1亚型,出生后18号外显子发生可变剪接形成短形式的Myom1成熟亚型。Myom1的成熟亚型可改善肌原纤维细丝的纵向排列,提高肌节的收缩效率。在Srsf5缺失的心脏中,18号外显子无法发生外显子跳跃,Myom1不能完成胚胎亚型和成熟亚型之间的转换,从而影响心脏的收缩功能。由此认为,Srsf5对Myom1可变剪接的调控在心脏发育过程中起着关键作用。本课题拟以构建的Srsf5基因敲除小鼠为实验对象,研究Srsf5对小鼠心脏发育中的作用,探讨Srsf5调控Myom1可变剪接对小鼠心脏功能的影响,为发育缺陷心脏疾病的研究及诊疗提供理论和实验依据。方法1.Srsf5基因敲除对小鼠生长发育的影响（1）Srsf5基因敲除小鼠模型的构建:采用CRISPER/Cas9技术敲除Srsf5基因外显子3至外显子6的序列,获得具有遗传能力的Srsf5基因敲除的杂合子小鼠;杂合子小鼠自交得到野生型（WT）、杂合子（Srsf5+/-）和纯合子（Srsf5-/-）3种基因型的子代小鼠;提取鼠尾基因组DNA,通过PCR实验鉴定子代小鼠基因型;通过RT-q PCR、Western blot和免疫组织化学染色方法检测Srsf5-/-小鼠各脏器中Srsf5的表达,以验证Srsf5基因敲除效果。（2）Srsf5基因敲除小鼠的生存期:统计E18.5天（Embryonic day 18.5）至P7天（Postnatal day 7）WT、Srsf5+/-和Srsf5-/-3种基因型小鼠的存活及死亡数量,绘制Kaplan-Meier生存曲线,分析Srsf5-/-小鼠的生存期。（3）Srsf5基因敲除小鼠的一般性状与组织病理学变化:观察出生前后Srsf5-/-小鼠的外观,测量体重及P1天Srsf5-/-小鼠心脏、肝、肺、脑、肾和脾的重量;骨组织染色观察P1天Srsf5-/-小鼠的骨骼形态;H&E染色检测Srsf5-/-小鼠心脏、肝、肺、脑、肾和脾的组织病理学变化。2.Srsf5基因敲除对小鼠心脏功能的影响（1）Srsf5基因敲除对小鼠心脏收缩功能与心脏电活动的影响:选取P1天Srsf5-/-小鼠,利用小动物超声心动图评估Srsf5-/-小鼠的心脏收缩功能;通过心电图监测Srsf5-/-小鼠的心脏电活动;采用RT-q PCR实验检测Srsf5-/-小鼠心脏组织中心肌损伤标志物ANF和BNP的表达。（2）Srsf5基因敲除对小鼠心肌致密化程度的影响:利用Endomucin和c Tn T免疫荧光染色分别标记心内膜轮廓和心肌层,测量Srsf5-/-小鼠心肌小梁和心肌致密层的厚度,通过计算心肌小梁厚度与心肌致密层厚度的比值,分析Srsf5-/-小鼠心脏的心肌致密化程度。（3）Srsf5基因敲除对小鼠心肌细胞增殖和凋亡的影响:免疫组织化学染色和TUNEL法分别检测P1天Srsf5-/-小鼠心肌组织中Ki67和p H3的表达以及心肌细胞凋亡。3.Srsf5基因敲除导致小鼠心脏功能障碍的作用机制（1）转录组测序筛选Srsf5基因敲除小鼠心脏中的差异可变剪接事件:对P0天WT和Srsf5-/-小鼠的心脏组织进行RNA-Sequence测序,利用r MATS软件分析基因的可变剪接事件,GO富集分析差异可变剪接基因的功能。（2）差异可变剪接事件的验证:通过RT-PCR检测Srsf5-/-小鼠心脏中候选基因不同异构体的表达,验证差异可变剪接事件。（3）Srsf5调控心脏中Myom1的可变剪接:Western blot检测胚胎发育中期至围产期的WT和Srsf5-/-小鼠心脏中Myom1的亚型转换;构建Myom1迷你基因,将Myom1迷你基因与不同剂量的Srsf5质粒共转染于HEK293T细胞系中,通过RT-PCR实验检测Myom1不同亚型的表达;利用RIP实验检测Srsf5蛋白与Myom1前体m RNA的结合。结果1.Srsf5基因敲除对小鼠生长发育的影响（1）Srsf5基因敲除小鼠模型的构建:共获得4只杂合子小鼠,2只雌性2只雄性;PCR结果显示,杂合子小鼠自交后代包括WT、Srsf5+/-和Srsf5-/-3种基因型;Srsf5-/-小鼠各脏器中均不表达Srsf5的m RNA和蛋白。说明,成功获得全身性敲除Srsf5的小鼠模型,并可稳定遗传后代。（2）Srsf5基因敲除小鼠的生存期:Kaplan-Meier生存曲线分析显示,Srsf5-/-胚胎于E18.5天全部存活,出生后2天内Srsf5-/-小鼠全部死亡。提示,Srsf5缺失导致小鼠围产期死亡。（3）Srsf5基因敲除小鼠的一般性状与组织病理学变化:与WT小鼠相比,Srsf5-/-小鼠体重明显减轻;Srsf5-/-小鼠心脏、肝脏、肺、双肾和脑的脏器重量和体重的比值与WT小鼠无显著差别,Srsf5-/-小鼠脾脏重量和体重的比值明显低于WT小鼠;Srsf5-/-小鼠的软骨发育未见异常。提示,Srsf5缺失可以引起小鼠发育迟缓。H&E染色结果显示,P1天Srsf5-/-小鼠肠、肺、肝脏、双肾、脑和脾脏均未见明显的结构性病理改变;E18.5天和P1天Srsf5-/-小鼠心肌致密层变薄,心肌小梁长而密,部分心肌细胞空泡变性。提示,Srsf5缺失导致小鼠心脏发育异常。2.Srsf5基因敲除对小鼠心脏功能的影响（1）Srsf5基因敲除对小鼠心脏收缩功能与心脏电活动的影响:小动物超声心动图结果显示,Srsf5-/-小鼠心脏射血分数和左室短轴缩短率均明显减少,提示小鼠左心室收缩功能减弱。心电图监测结果显示,Srsf5-/-小鼠心率减缓,PR间期和QT间期延长,提示Srsf5-/-小鼠心脏出现轻度房室传导阻滞。RT-q PCR结果显示,心肌损伤标志物脑钠肽（BNP）在Srsf5-/-小鼠心脏组织中表达明显上调,提示Srsf5缺失导致小鼠心肌损伤。（2）Srsf5基因敲除对小鼠心肌致密化程度的影响:免疫荧光染色结果显示,Srsf5-/-小鼠心室壁的非致密层与致密层厚度比值明显大于WT小鼠,表现为心室肌致密化不全。提示,Srsf5缺失可导致小鼠心室肌致密化不全性心肌病。（3）Srsf5基因敲除对小鼠心肌细胞增殖和凋亡的影响:免疫组织化学染色结果显示,Srsf5-/-小鼠心肌组织中Ki67和p H3的表达明显下调,表明Srsf5缺失导致小鼠心肌细胞增殖减少。TUNEL结果显示,WT和Srsf5-/-小鼠心脏中细胞凋亡率没有明显差异。3.Srsf5基因敲除导致小鼠心脏功能障碍的作用机制（1）转录组测序筛选Srsf5基因敲除小鼠心脏组织的差异可变剪接事件:转录组测序结合r MATS软件分析共筛选583个差异的可变剪接事件,涉及5种可变剪接类型,其中外显子跳跃（Skipped Exon,SE）是主要的差异可变剪接事件。GO分析显示,差异剪接基因在肌肉收缩和心脏发育相关的功能中显著富集。（2）差异可变剪接事件的验证:RT-PCR技术验证5个心脏疾病相关的差异可变剪接事件。结果显示,Srsf5-/-小鼠心脏中Myom1和Ap1b1包含相关外显子的转录本表达减少,Col4a3bp、Tgfb2和Cnot2去除相关外显子的转录本表达增加。表明,Srsf5同时具有促进外显子保留和跳跃的双重功能。（3）Srsf5调控心脏中Myom1的可变剪接:Western blot结果显示,E13.5天至P1天Srsf5-/-小鼠心脏中Myom1无法发生亚型转换,提示在心脏不同发育时期Srsf5是Myom1亚型转换的关键调节因子。Myom1迷你基因与Srsf5质粒共转染实验的RT-PCR结果显示,随着Srsf5转染量增多,去除第18号外显子的Myom1转录本表达量逐渐增多,提示Srsf5以剂量依赖形式促进Myom1第18号外显子的跳跃。RIP实验结果显示,Srsf5与Myom1前体m RNA直接结合,说明Srsf5直接调控Myom1可变剪接。结论1.Srsf5缺失导致小鼠围产期死亡,生长发育异常,表明Srsf5在小鼠出生早期生存中发挥关键作用。2.Srsf5缺失导致小鼠心室肌致密化不全,心脏功能障碍,提示Srsf5在小鼠心脏发育过程中发挥重要作用。3.Srsf5通过调控出生前后心脏中Myom1的亚型转换维持小鼠心脏功能。